基于熵权法的正交试验优选小儿宝泰康颗粒醇提工艺

张清文，汪正宇

（1.皖北煤电集团总医院药剂科，安徽 宿州 234000；2.安徽省宿州市食品药品检验检测中心，安徽 宿州 234000）

小儿宝泰康颗粒多用于治疗小儿风热外感引起的发热、流涕、咳嗽和脉浮等证［1］，对上呼吸道感染有较好疗效［2］。该药由连翘、南板蓝根、滇紫草、地黄、玄参、滇柴胡等12味药材组方，现收载的2020年版《中国药典（一部）》中仅以紫外-可见分光光度法测定制剂中浙贝母总生物碱含量，对其他药材有效成分均无定量检测要求。本研究中以连翘中连翘苷和连翘酯苷A含量、滇柴胡中柴胡皂苷d含量、甘草中甘草酸和绿原酸含量为评价指标，采用熵权法确定各指标权重系数并进行综合评分，设计L9（34）正交试验，以料液比、甲醇体积分数及提取时间为考察指标，通过直观分析和方法分析优选最佳醇提工艺，为小儿宝泰康颗粒进一步开发利用提供技术支持。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ME204E型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

小儿宝泰康颗粒［健民集团叶开泰国药（随州）有限公司，批号分别为210109，210118，210237，210232］；绿原酸对照品（批号为110753-202119，含量96.3%），连翘酯苷A对照品（批号为111810-202108，含量96.2%），连翘苷对照品（批号为110821-201816，含量95.1%），柴胡皂苷d对照品（批号为110778-201912，含量96.3%），甘草酸铵对照品（批号为110731-202021，含量96.2%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min时5%A，10 min时25%A，25 min时30%A，40 min时55%A，60 min时55%A，70 min时5%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取各对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL分别含绿原酸0.450 mg、连翘酯苷A 0.550 mg、连翘苷1.600 mg、柴胡皂苷d 0.160 mg、甘草酸铵0.330 mg的混合对照品贮备液；精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液：取样品内容物适量，研细，取细粉约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇30 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取，冷却至室温，再次称定质量，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按小儿宝泰康颗粒处方和制备工艺制备缺连翘、滇柴胡、甘草的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.1.2项下3种溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、柴胡皂苷d、甘草酸铵色谱峰与相邻峰分离良好（分离度>1.5），理论板数以连翘苷峰计大于5 000。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Chlorogenic acid 2.Forsythoside A 3.Forsythin 4.Saikosaponin d 5.Ammonium glycyrrhizinateA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.1.2项下混合对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。精密量取10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

检测限与定量限考察：分别精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，加50%甲醇倍比稀释，按2.1.1项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）3∶1及10∶1时的进样量分别记作检测限及定量限。结果见表1。

表1 回归方程、线性范围与检测限、定量限Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

精密度试验：取2.1.2项下混合对照品溶液适量，按2.1.1项下色谱条件，连续3 d、每天1次和1 d内连续进样测定6次，记录峰面积。结果绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、柴胡皂苷d、甘草酸铵峰面积的RSD，日间精密度分别0.62%，0.81%，0.18%，0.50%，0.67%（n=3），日内精密度分别0.21%，0.43%，0.15%，0.20%，0.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2项下供试品溶液（批号为210109）适量，分别于常温下放置0，3，6，9，12，18，24，36，48 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、柴胡皂苷d、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.36%，0.78%，0.64%，1.22%，0.53%（n=9），表明供试品溶液在室温放置48 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为210109）适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液6份，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、柴胡皂苷d、甘草酸铵的平均含量分别为1.985，2.786，7.911，0.705，1.698 mg/g，RSD分别为0.52%，0.78%，0.33%，0.89%，0.42%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号为210109）内容物适量，研细，取细粉约0.3 g，精密称定，共6份，分别精密加入混合对照品贮备液1 mL，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2 正交试验

试验设计与结果：以料液比（A）、甲醇体积分数（B）和提取时间（C）为考察因素，绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、柴胡皂苷d、甘草酸铵含量为评价指标，采用L9（34）正交试验法考察，因素与水平见表3，正交试验设计方案及结果见表4，方差分析结果见表5。

表3 因素与水平Tab.3 Factors and their levels

表4 L9（34）正交试验设计与结果Tab.4 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表5 方差分析结果Tab.5 Results of the ANOVA

结果分析：熵权法确定各指标权重关系为，柴胡皂苷d>绿原酸>甘草酸铵>连翘酯苷A>连翘苷，各考察因素对综合评分影响程度为A>B>C，且仅因素A，C对综合评分结果有显著影响（P<0.05）。正交试验设计校正模型的P<0.05，说明试验设计科学合理。综上所述，确定最优提取工艺条件为A2B2C3，即料液比为1∶50（g/mL），甲醇体积分数为50%，提取时间为90 min。

2.3 验证试验

取3批样品适量，每批平行3份，按优选的醇提工艺提取，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算各成分含量。结果显示，3批样品试验结果的RSD均小于0.40%（n=3），表明该优选醇提工艺较稳定。详见表6。

表6 验证试验结果（mg/g，n=3）Tab.6 Results of the validation test（mg/g，n=3）

3 讨论

小儿宝泰康颗粒组方中，连翘为君药，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效，主要成分为连翘苷和连翘酯苷A［3-5］；滇柴胡产自云南，具有解表散寒、疏肝和胃等功效，主要成分为柴胡皂苷类化合物［6-7］；甘草具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、神经保护、肝脏保护等药理作用，含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类等多种化合物［8-12］。关于小儿宝泰康颗粒有效成分研究文献较少，沈立茹等［11］采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定制剂中贝母素甲与贝母素乙含量，宣蓓蓓等［12］研究了该制剂的指纹图谱及7种成分含量。中药治病机制较复杂，故对于中成药质量考察应结合中医理论综合进行评价［13-14］。

预试验中先后考察了加热回流和超声提取两种提取方式，发现在相同条件下两者各成分含量差异不明显，故选择操作更简便的超声提取；提取溶剂选择时，考察甲醇、乙醇及水3种溶剂，结果以水为溶出介质时，连翘酯苷A、柴胡皂苷d未被检测出，且甲醇的提取效果比乙醇好，故采用甲醇作溶剂。

目前确定指标属性权重方法有主观赋权法、客观赋权法和主客观赋权法（或组合赋权法）三大类，熵权法属客观赋权法，近年来多用于中药多指标成分分析中［15-18］。其根据各指标的变异程度，利用信息熵计算出各指标的熵权，再通过熵权对各指标的权重进行修正，从而得到较客观的指标权重。本研究中以料液比、甲醇体积分数和提取时间为考察因素，以熵权法确定各指标权重求算综合评分，通过正交试验法得出最优醇提工艺条件，并通过验证试验验证。该工艺条件稳定性较好，简单实用，可为小儿宝泰康颗粒进一步开发利用提供参考。