壳寡糖修饰盐酸川芎嗪PLGA微球体外评价*
2022-10-12吴铄珺王曙东刘文雅
吴铄珺,王曙东,苏 华,刘文雅
(中国人民解放军东部战区总医院药剂科,江苏 南京 210012)
川芎嗪是中药川芎的主要有效成分,可有效抑制 肺癌细胞、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞的增殖与迁移,诱导凋亡和自噬[1-2]。川芎嗪主要以盐酸川芎嗪(LTH)和磷酸川芎嗪形式存在,其分子中的甲基易被氧化代谢,存在代谢快、半衰期短、生物利用度低等缺点,临床使用须频繁给药,易致蓄积性中毒。将其制成缓释制剂,有利于提高疗效及降低毒副作用[3]。查阅文献发现,利用MCF-7及A549细胞培养模型,可检测川芎嗪纳米粒的细胞毒性。细胞摄取试验结果表明,修饰后的主动靶向纳米粒的摄取量、荧光强度均显著高于川芎嗪溶液[4]。为此,本研究中以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料,制备壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪缓释微球(COS-LTH-MS)并进行体外评价,旨在为中药抗肿瘤制剂的开发提供实验室数据。现报道如下。
1 仪器、试药与细胞[5]
1.1 仪器
ER-182A型电子分析天平(日本A&D公司);Waters 1525型高效液相色谱仪,含717型自动进样器、2487型紫外检测器、Waters Empower色谱软件(美国Waters公司);Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo公司);85-2型温控磁力搅拌器(江苏金怡仪器科技有限公司);SM-650D型超声波细胞粉碎机(南京贝帝实验仪器有限公司);TM3000型台式扫描电镜(上海辛茨精密仪器有限公司);ZS90型纳米粒径测定仪(厦门亿恩达科技有限公司);Eppendorf 5427型低速离心机(北京欣兴强森生物科技有限公司);Bio-Rad iMark酶标仪(上海麦莎生物科技有限公司);Thermo CO2培养箱(赛默飞世尔科技<中国>有限公司);TCS SP2型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
1.2 试药
盐酸川芎嗪原料药(北京燕京药业有限公司,批号为180605);盐酸川芎嗪对照品(中国食品药品检定研究院,批号为110817-200305,含量98%);聚乙烯醇(PVA,上海五四试剂厂,批号为181022);PLGA(济南岱罡生物工程有限公司,批号为181115);壳寡糖(COS,青岛博智汇力生物科技有限公司,批号为190103);2-(N-吗啉)乙磺酸(MES,爱尔兰Megazyme公司,批号为181025);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,批号为800107)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,批号为A1016),均购自美国Sigma公司;RPMI 1640培养基(批号为30030)、胎牛血清(FBS,批号为11012),均购自美国Gibco公司;CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所,批号为CK04);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为双蒸水。
1.3 细胞
人乳腺癌MCF-7细胞株、人肺腺癌A549细胞株,均由美国菌种保藏中心(ATCC)提供。
2 方法与结果
2.1 COS-LTH-MS制备
采用复乳-溶剂挥发法[6]。称取PLGA约200 mg,溶于5 mL乙酸乙酯-二氯甲烷(3∶2,V/V)的混合溶液中,作为有机相,备用。取盐酸川芎嗪150 mg,精密称定,溶于5 mL水中,取0.5 mL作为内水相,缓慢加入有机相中,冰浴下超声(功率250 W,频率40 Hz,下同)处理形成油包水(W/O)的初乳,缓慢倾入10 mL的1%PVA溶液中,超声处理10 min形成复乳(W/O/W),倾入15 mL的1%PVA溶液中,磁力搅拌4 h,使有机溶剂挥发,高速离心,收集固化的微球[7],用水洗涤3遍,冷冻干燥[8],得到盐酸川芎嗪微球(LTH-MS),分散于适量MES缓冲液(pH 5.0)中,加入35 mg EDC和15 mg NHS活化,将上述壳寡糖溶液加入上述反应体系中,室温下搅拌48 h,离心分离后冷冻干燥,得COS-LTH-MS[5]。初步检测,该微球表面形态光滑圆整、尺寸可控;载药量达19.05%,包封率为68.16%,体外释放24 h达到平稳状态,累积释放量78.23%,显示出一定的缓释特性。
2.2 微球体外靶向性考察
2.2.1 细胞毒性
采用CCK-8法。取对数生长期的MCF-7和A549细胞(1×104个),用胰酶消化后进行细胞计数,铺入96孔板中培养。分为实验组[0.014,0.028,0.056,0.112,0.224,0.448 mg/mL的COS-LTH-MS(载药量为20.02%)]、对照组(相应质量浓度的空白微球)及空白组(培养基),各设3个平行孔,进行24 h常规培养[9]。实验当天,换无血清培养液,加1%牛血清蛋白(BSA),各组给予相应微球或培养基处理[5]。作用24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,继续培养4 h后测定其在450 nm波长处的吸光度(OD)值[5]。细胞生长率=实验组OD值/空白组OD值×100%。
给药24 h后,空白微球在给药浓度范围内对MCF-7和A549细胞基本无毒性。当0.056 mg/mL COS-LTH-MS作用24 h后,MCF-7和A549细胞生长率均在95%以上(图1),表明0.056 mg/mL为COS-LTH-MS的细胞低毒性质量浓度。故选择此质量浓度作为后续试验的给药浓度。
图1 细胞毒性试验结果A.Control group B.Test groupFig.1 Results of the cytotoxicity test
2.2.2 细胞内LTH质量浓度
取对数生长期的MCF-7和A549细胞(1×106个),分别接种于T75培养瓶中,分为LTH溶液组、LTH-MS组和COS-LTH-MS组,均分别作用1,2,8,12,24 h后,细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,用胰酶消化细胞,1 000 r/min离心5 min,弃上清,收集细胞并加甲醇100 μL,-80℃反复冻融3次,使细胞破碎。高速离心后收集上清液,检测细胞内LTH含量。
采用高效液相色谱(HPLC)法测定LTH含量。色谱条件[10-11]:色谱柱为Sepax GP-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为水-甲醇(52∶48,V/V),流速为1 mL/min,检测波长为290 mm,柱温为35℃,进样量为10 μL。LTH出峰时间约为9 min,峰形良好,阴性对照无干扰;成功建立LTH质量浓度线性方程;精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%;平均加样回收率为98.72%,RSD为1.04%(n=9)。
结果表明,随给药时间的延长,A549细胞和MCF-7细胞内药物质量浓度逐渐升高,体现出一定的浓度依赖性。修饰后的微球由于PLGA外层包裹壳寡糖,药物须经壳寡糖缓慢降解后释放,给药12 h后,细胞内药物质量浓度达到饱和。2种细胞内LTH质量浓度变化情况见表1和表2。可见,经壳寡糖修饰后的微球能将LTH更多地靶向肿瘤细胞中,且MCF-7较A549细胞更明显。
表1 A549细胞内川芎嗪质量浓度(±s,μg/mL)Tab.1 Mass concentration of ligustrazine in A549 cells(±s,μg/mL)
表1 A549细胞内川芎嗪质量浓度(±s,μg/mL)Tab.1 Mass concentration of ligustrazine in A549 cells(±s,μg/mL)
注:与LTH溶液组比较,*P<0.05,**P<0.01;与LTH-MS组比较,#P<0.05,##P<0.01。表2同。Note:Compared with those in the LTH solution group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with those in the LTH-MS group,#P<0.05,##P<0.01(for Tab.1-2).
?
表2 MCF-7细胞内盐酸川芎嗪质量浓度(±s,μg/mL)Tab.2 Mass concentration of ligustrazine hydrochloride in MCF-7 cells(±s,μg/mL)
表2 MCF-7细胞内盐酸川芎嗪质量浓度(±s,μg/mL)Tab.2 Mass concentration of ligustrazine hydrochloride in MCF-7 cells(±s,μg/mL)
?
2.2.3 细胞对微球的摄取
采用激光共聚焦显微镜观察。取对数生长期的MCF-7及A549细胞(1×104个),分别接种于共聚焦专用培养皿(直径60 mm),分组同2.2.2项,分别加药干预12 h。弃去培养基,PBS洗涤3次。设置发射光波长为526 nm,激发光波长为488 nm,置激光共聚焦显微镜下观察。可见LTH溶液组自发绿色荧光,COS-LTH-MS组的荧光强度显著高于LTH-MS组和LTH组,MCF-7细胞较A549细胞荧光强度更大,详见图2。推测可能是经修饰的川芎嗪微球与MCF-7细胞特定的配体结合,进入靶向部位,使MCF-7细胞内荧光较明显。
图2 激光共聚焦荧光强度图(×40)A1,B1.LTH solution group A2,B2.LTH-MS group A3,B3.COS-LTH-MS groupA.A549 cells B.MCF-7 cellsFig.2 Fluorescence intensity spectra of laser-scanning confocal microscopy(×40)
3 讨论
新型药物载体系统多有缓释性和靶向性的特点,微球也不例外。高分子化合物均有良好的生物相容性和可降解性,PLGA是应用和研究较广泛的载体材料之一[12]。为提高LTH的生物利用度,增强疗效,将其制备成PLGA缓释微球。由于川芎嗪是水溶性药物,药物黏附在微球表面,微球在释放介质中溶胀后经孔道释放的速度较快,释放初期药物存在突释,可能导致血药浓度高于治疗浓度[13],迫切需要解决。本研究中是采用EDC和NHS活化,将PLGA的羧基端与壳寡糖的游离氨基共价连接,制得壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪PLGA微球[5]。体外释药实验表明,修饰后的微球由于PLGA外层包裹壳寡糖,药物须经壳寡糖缓慢降解后释放,突释效应减小,为水溶性中药缓释制剂的研究提供了参考[5]。
壳寡糖为带正电荷的阳离子碱性低聚糖,具有吸收能力强、生物活性高等优点,同时具备调节免疫、抗肿瘤等生理活性[14-15]。由于其相对分子质量小,易进入细胞,负载的药物可通过受体结合机制和静电吸附作用转移到肿瘤细胞中,从而增加细胞内药物浓度,增强抗肿瘤作用。体外细胞试验也证实,修饰微球的摄入量明显优于未修饰微球,说明壳寡糖修饰微球对肿瘤细胞具有更强的靶向性。未经修饰的微球缺少主动靶向性,在体外细胞试验中其作用明显低于盐酸川芎嗪原料药,推测可能是因有特定的配体与靶细胞的受体结合,细胞表面凹陷,形成内涵体,内涵体在细胞内酸化破裂而释药,或因细胞摄取机制等原因,改变未经修饰的微球在体内的自然分布,从而到达特定的靶向部位,亦可将药物修饰成前体药物,在药理学惰性物质的活性部位被激活,特别是靶功能被激活发挥作用,但明确的机制还有待进一步研究[5],下一步还将进行体内实验,并考察其在体内的组织分布等情况。制备盐酸川芎嗪靶向微球,可提高肿瘤细胞内药物质量浓度,减缓释放速度,增强靶向作用,应用于抗肿瘤前景良好。