基于网络药理学和分子对接探讨当归芍药散治疗原发性痛经的作用机制Δ

李 敏，郭 淼，陈 萍，翟凤霞，孙建华，李 娜

(1.河南中医药大学第一临床医学院，郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院妇产科，郑州 450000；3.广州中医药大学第一附属医院妇科，广州 510405)

原发性痛经(primary dysmenorrhea，PD)指育龄期女性机体没有器质性病变的情况下，经行前后或月经期出现下腹部疼痛、坠胀，伴有腰酸或其他不适[1]。该病呈周期性反复发作，病程长，发病率高，我国痛经发生率为33.1%，其中原发性痛经占90%，影响了育龄期女性的生活和工作[1-2]。临床应用当归芍药散治疗PD的疗效确切，无不良反应[3]。当归芍药散可调节血管舒缩物质，抑制子宫收缩，改善子宫血供，从而发挥对PD的治疗作用[4]。在网络药理学的支持下，本研究拟探究当归芍药散治疗PD的活性物质及活性物质的作用靶点、作用通路，并通过分子对接方法验证活性物质与作用靶点的结合性，为临床推广应用和进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 筛选当归芍药散活性成分及其靶点

分别以“当归”“白芍”“川芎”“白术”“茯苓”和“泽泻”为关键词，借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[5]查找其活性成分，筛选出符合药动学参数口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18[6]的活性成分及相对应的靶基因，在UniProt数据库[7]中优化。删除无对应靶基因的活性成分，去重，分别建立活性成分数据集和药物靶基因数据集。

1.2 获取PD相关疾病靶基因

在GeneCards[8]、人类孟德尔遗传综合数据库[9]中检索，获得PD相关的疾病靶基因。去重后，建立疾病靶基因数据集。

1.3 构建核心靶基因蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)

运用R软件[10]将药物成分靶基因和疾病靶基因进行交集，得出当归芍药散作用于PD的核心靶基因集，并绘制韦恩图。将筛选得到的核心靶点集置入STRING 11.0平台[11]，最低相互作用阈值设为>0.4，其余参数保持默认设置，获得核心靶点相互作用关系，并运用Cytoscape软件可视化。

1.4 构建活性成分-作用靶点网络图

创建“药物-成分”“成分-靶点”及“疾病-靶点”关系文件，将其导入Cytoscape软件[12]，构建“活性成分-作用靶点”网络。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将所有核心靶点导入DAVID数据库[13]，设定阈值P<0.05，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。并根据富集基因数量选择靠前的条目，分别通过Excel软件及R软件将其结果可视化。

1.6 当归芍药散活性成分与靶点的分子对接

将PPI网络中排序靠前的关键靶点分别与对应的活性成分进行分子对接，验证成分-靶点之间的可能性。在PubChem数据库中找到活性成分的化学结构及二维结构，在ChemOffice软件中进行三维化及优化，并在AutoDockTools软件中转化成pdbqt格式。通过PDB数据库获取靶蛋白的结构、化学结构，利用PyMOL软件删除水分子，并在AutoDockTools软件中添加氢离子、转化成pdbqt格式等预处理。最终在AutoDockTools软件中实现vina对接，得到分子对接得分数据，并在PyMOL软件实现可视化。

2 结果

2.1 当归芍药散活性成分及其靶点的获取与筛选

在TCMSP数据库中，根据相应条件筛选、去重后，最终得出54个药物的有效活性成分及100个药物靶点基因。

2.2 PD疾病靶点的获取与PPI网络的构建

在2个疾病基因数据库中收集疾病的致病靶点，获得406个PD相关的疾病靶点。将其与100个药物成分靶点通过R软件绘制韦恩图(见图1)，两者取交集后，获得共同核心靶点23个。将当归芍药散与PD相关的23个核心靶点导入STRING数据库获取的相互作用关系，再借助Cytoscape软件绘制PPI网络图，见图2。该网络图共包括节点23个，边90个；图中度值越大则颜色越深，位置越靠近圆的中心。结果提示，药物成分-疾病共同核心靶点中度值最高的6个关键节点为前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、雌激素受体1(ESR1)、蛋白激酶B1(Akt1)、芳基烃受体(AHR)、孕激素受体(PGR)、谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)和胱天蛋白酶3(CASP3)。

图1 当归芍药散活性成分-PD靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of Danggui Shaoyao powder active components-PD targets

图2 当归芍药散治疗PD核心靶点的PPI网络图Fig 2 PPI network of core targets of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.3 当归芍药散治疗PD的活性成分-作用靶点网络拓扑图构建

应用Cytoscape软件构建当归芍药散中活性成分-作用靶点共表达的网络拓扑图(见图3)，该网络图共包括节点42个，边57条；23个方形节点代表作用靶点，19个圆形节点代表当归芍药散作用于PD的有效活性成分。其中，山柰酚(MOL000422，kaempferol)、β-谷甾醇(MOL000358，beta-sitosterol)、杨梅酮(MOL002135，myricanone)和豆甾醇(MOL000449，stigmasterol)等与靶基因连线最多，为主要的活性成分。

图3 当归芍药散作用于PD的活性成分-作用靶点网络图Fig 3 Active components-targets network of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.4 当归芍药散治疗PD核心靶点GO功能富集分析

GO功能富集分析中，根据富集基因数目，分别在生物过程、细胞组分及分子功能3个方面共筛选出12个GO生物过程条目，见图4。柱状图居上者为系列1，表示该条目Count值；居下者为系列2，表示该条目基因数目占所有基因总数的比例。生物过程功能包括序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、棕色脂肪细胞分化、细胞氧化剂解毒和血压调节；细胞组分中的定位包括线粒体、细胞溶质、内质网膜和高尔基体；分子功能包括血红素结合、铁离子结合、谷胱甘肽转移酶活性和核心启动子序列特异性DNA结合。

图4 当归芍药散治疗PD核心靶点GO功能富集分析柱状图Fig 4 Histogram of GO enrichment analysis of core targets of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD

2.5 KEGG通路富集分析当归芍药散治疗PD的通路

根据富集基因数量，选择前20条通路进行气泡图展示，见图5。由图可见，当归芍药散治疗PD的KEGG富集通路主要有丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路、钙信号通路和核因子κB(NF-κB)信号通路等。可见，当归芍药散可通过调节多条通路发挥治疗PD的作用。

图5 当归芍药散治疗PD的KEGG通路富集分析图(前20条通路)Fig 5 KEGG enrichment analysis of Danggui Shaoyao powder in the treatment of PD (top 20 pathways)

2.6 分子对接验证结果

利用AutoDockTools软件对PPI网络中排序居前6位的关键靶点与相应的活性成分进行分子对接后，得到对接的自由能，见表1。其中山柰酚与PTGS2的结合的自由能最小，山柰酚与PTGS2结合后呈现稳定状态，见图6。

图6 山柰酚与PTGS2的分子对接图Fig 6 Molecular docking diagram of kaempferol and PTGS2

表1 当归芍药散有效化合物与作用靶蛋白的对接结果Tab 1 Docking results of effective compounds of Danggui Shaoyao powder and target proteins

3 讨论

本研究通过网络药理学方法对当归芍药散治疗PD的作用机制进行了较为系统的分析，结果显示，共筛选出19个潜在活性成分，其中当归芍药散的主要活性成分包括山柰酚、β-谷甾醇、杨梅酮和豆甾醇等。PD的发生是由于月经来潮时，子宫内膜前列腺素(PG)在炎症刺激下，经一系列合成酶促代谢反应产生并释放PGF2α[14]。生理状态下，PGF2α在大部分细胞中处于沉默状态，当机体出现炎症反应时，PGF2α活性显著表达。环氧合酶2(COX-2)是PGF2α合成步骤的关键酶[15]。研究结果表明，在炎症反应中，山柰酚可以使转录因子(STAT3)和NF-κB失活，以此减弱白细胞介素(IL)6诱导的THP-1细胞中COX-2的表达[16]；通过降低NF-κB p65、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)α水平发挥抗炎作用，缓解小鼠神经根疼痛[17]。β-谷甾醇、豆甾醇对脂多糖诱导的单核巨噬细胞(RAW264.7)具有抗炎作用。研究结果表明，植物甾醇类化合物均能减轻脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应，抑制细胞吞噬功能、TNF-α释放、COX-2和p-ERK的表达和活性[18]。其中，β-谷甾醇的抗炎活性高于豆甾醇。杨梅酮对炎症反应中的细胞因子具有调节作用，通过抑制巨噬细胞中的NF-κB和STAT1活化及诱导出血红素加氧酶1(HO-1)的抗炎活性[19]。另有研究结果显示，在脂多糖诱导的炎症模型中，杨梅素能显著降低诸多细胞炎症因子的活性[20]。以上说明，当归芍药散的主要有效活性成分通过抑制炎症反应，下调COX-2的表达水平，抑制PGF2α活性，达到缓解经期疼痛的作用。

PPI网络显示，当归芍药散治疗PD是通过多靶点实现的。袁立明等[21]发现，PD大鼠子宫平滑肌中COX-2表达水平上调，表明PD是一种炎症反应过程。性激素参与PD的发病。国内研究结果发现，雌激素水平与痛经的疼痛程度呈正相关关系，孕激素水平则呈负相关关系[22]。即雌激素升高促进PG的合成与释放，从而促使平滑肌痉挛，孕激素则与之表现出拮抗的作用。进一步研究结果发现，二者相应的受体，即ESR、PGR也参与了PD病理的发生[23]。通过降低ESR mRNA水平，提高PGR mRNA水平，可缓解子宫平滑肌痉挛，从而发挥治疗作用。分子对接结果亦显示，山柰酚与靶基因COX-2结合较为稳定。

KEGG通路富集分析结果显示，当归芍药散治疗PD是通过多条信号通路作用的，其中MAPK信号通路、NF-κB信号通路和钙信号通路等相关研究较多。NF-κB信号通路中的NF-κB因子是一种炎症反应及免疫表达的转录调节因子，能够调控COX-2的表达与活性[24]。唐文静等[25]发现，PD大鼠中NF-κB的磷酸化水平升高，以此活化COX-2调控PGF2α的合成和分泌。当归芍药散可以通过抑制NF-κB信号通路，抑制炎症反应，发挥抗炎免疫作用，以此达到缓解疼痛的效果[26]。MAPK信号通路是细胞内外信号传递的信使通路，MAPK被应激刺激激活后，其磷酸化级联反应可触发下游多种转录因子的激活，从而调节相关基因的表达，影响生物信号传递，促进子宫平滑肌收缩[27]。细胞内钙离子的释放或细胞外钙离子的内流参与子宫平滑肌的收缩[28-29]。关于GO功能富集方面，主要集中在序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、分子功能包括血红素结合、铁离子结合、谷胱甘肽转移酶活性和核心启动子序列特异性DNA结合等方面，上述生物学过程和功能体现在复方药物活性成分调节对应靶点和具体通路过程中。

综上所述，当归芍药散治疗PD具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，本研究结果探讨了当归芍药散的基本药理学作用和相关机制，并为进一步的基础研究奠定了良好基础。