高效液相色谱法同时测定广东紫珠中5种成分的含量Δ

吴颖欣，王汝上，林明越

(1.佛山市中医院西药房，广东 佛山 528000；2.广州康臣药物研究有限公司研发中心，广州 510530；3.佛山市中医院制剂中心，广东 佛山 528000)

广东紫珠CallicarpakwangtungensisChun为马鞭草科紫珠属落叶小灌木，通常高约2 m，主要分布于江西、湖南、福建、广东和广西等南方地区的低海拔山林之中[1]。广东紫珠原为江西萍乡地区民间习用药，最早被收载于1996年《江西省药材标准》[2]；由于其疗效确切，应用较为广泛，是中成药抗宫炎片、抗宫炎颗粒的主要原料之一，随后于2010年被新增收载于《中华人民共和国药典：一部》[3]。近年来，随着对广东紫珠资源的不断开发，对其所含化学成分研究的报道日益增加，从广东紫珠地上部分分离鉴定到黄酮类、酚酸类、三萜类和苯丙素类等数十种化合物，包括含量较高的金石蚕苷、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素及木犀草苷[4-8]。

广东紫珠以其干燥茎枝和叶入药，中医认为其具有收敛止血、散瘀、清热解毒的功效，可用于衄血、咯血、吐血、便血、崩漏、外伤出血及肺热咳嗽等症状[9]。药理学研究结果显示，广东紫珠具有抗炎[10-11]、抗菌[12-13]和止血[14-15]等活性，其所含的苯丙素类、黄酮类成分为其潜在主要药理活性成分。动物抗炎实验结果显示，广东紫珠含有的苯丙素类成分连翘酯苷B能有效抑制小鼠耳肿胀及降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素(IL)6水平[16]；体外细胞抗炎实验结果显示，连翘酯苷B、金石蚕苷和毛蕊花糖苷对脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞增殖具有较强抑制作用，并能降低细胞内TNF-α和IL-6水平[16]。上述研究结果提示，3种苯丙素类苷类化合物均具有较强的抗炎作用。广东紫珠中的木犀草素和木犀草苷等主要黄酮类化合物经药效评价显示具有抗炎、止血作用，这可能是广东紫珠具有收敛止血、清热解毒功效的主要活性部位[17-19]。中药具有多成分、多靶点、多通路协同作用特点，其所含活性成分众多，作用机制复杂多样，采用限定1～2个化合物含量的传统质控方法常具有较大片面性，难以充分反映药材真实质量信息。因此，建立以有效成分为核心的多指标中药质控体系方法具有较大现实意义。现行药典仅对广东紫珠中金石蚕苷及连翘酯苷B的含量做出规定，而毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷作为其中含量较高、药理活性明确的有效成分未见有相关含量研究报道。因此，本研究采用高效液相色谱(HPLC)法对广东紫珠中的连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷5种主要有效成分进行含量测定，以期为广东紫珠质量标准的进一步提升提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪(PDA检测器，美国Waters公司)；ME204E万分之一分析天平(d=0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；KQ-300DE型超声波清洗器(功率为300 W，频率为40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)；AX-205十万分之一电子天平(d=0.000 01 g，瑞士Mettler公司)；CX-500A型高速多功能粉碎机(上海市晟喜制药机械有限公司)；Milli-Q Synergy型超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

广东紫珠购自广州清平药材市场，产地为广西桂林市(8批均采自同一种植基地)，采收时间为2019年8月至2019年11月，经广州康臣药物研究有限公司王汝上高级工程师鉴定为马鞭草科植物广东紫珠CallicarpakwangtungensisChun的干燥茎枝及叶。连翘酯苷B(批号：111811-201603；含量以96.6%计)、金石蚕苷(批号：111812-201303；含量以96.9%计)、毛蕊花糖苷(批号：111530-201914；含量以95.2%计)、木犀草素(批号：111520-201605；含量以99.6%计)及木犀草苷(批号：111720-201810；含量以93.5%计)对照品均购自中国药品食品检定研究院。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸(色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)；其余所用试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

将采购的广东紫珠低温干燥过夜，迅速粉碎后过三号药筛，称取过筛后的干粉约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，50 ℃下超声提取30 min，室温(25 ℃)放冷后，用70%甲醇补足减失重量；摇匀后静置取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得广东紫珠供试品溶液。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取木犀草苷、连翘酯苷B、木犀草素、金石蚕苷和毛蕊花糖苷对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加入适量70%甲醇超声溶解，放冷至室温后用70%甲醇定容至刻度，制得连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷及木犀草素浓度分别为1.857、1.533、0.562、0.129及0.354 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件及系统适应性考察

色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相为乙腈(A)-0.1%乙酸水(B)，梯度洗脱：0～5 min，20%A；5～20 min，20%～50%A；20～30 min，50%A；30～70 min，50%～80%A。流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

取空白提取溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液，依照上述该色谱条件进样分析，观测5种待测成分峰形、分离度和理论塔板数等指标。结果显示，5种待测成分色谱峰峰形尖锐对称，无峰前沿或拖尾，分离度均≥1.5，理论塔板数按照连翘酯苷B计算不低于3 000，连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素保留时间分别为17.911、26.026、39.767、45.480和57.003 min，表明该方法专属性良好。空白提取溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

A.空白对照品；B.混合对照品；C.供试品；1.连翘酯苷B；2.金石蚕苷；3.毛蕊花糖苷；4.木犀草苷；5.木犀草素A.blank control;B.mixed reference substance;C.test samples;1.forsythiaside B;2.poliumoside;3.verbascoside;4.galuteolin;5.luteolin图1 HPLC图Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0和2.0 mL至10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，充分混合均匀后即得梯度浓度混合对照品工作液。按上述色谱条件进行测定，以对照品浓度为横坐标(X)，以对应色谱峰峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算得回归方程，结果见表1。

表1 5个成分的标准曲线回归方程Tab 1 Regression equation of standard curve of 5 components

2.5 检测限、定量限考察

取最低浓度的混合对照品工作液(连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素浓度分别为46.43、38.33、14.05、3.23和8.85 μg/mL)，用70%甲醇稀释成系列浓度的溶液。分别按照上述色谱条件进样分析，以信噪比S/N=3为检测限(LOD)，以信噪比S/N=10为定量限(LOQ)。结果显示，连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素的LOD分别为0.348、0.383、0.281、0.215和0.295 ng，LOQ分别1.160、1.277、0.936、0.717和0.983 ng。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验：取混合对照品溶液按上述色谱条件连续重复测定6次，记录5种待测成分峰面积并计算RSD。结果显示，连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素6次测定峰面积的RSD分别为0.46%、0.48%、0.67%、0.53%和0.98%(n=6)，表明该仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性试验：取供试品溶液按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12和24 h时进样分析，记录5种待测成分峰面积并计算RSD。结果显示，24 h内6次进样连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素峰面积的RSD分别为0.84%、0.58%、0.78%、0.69%和0.54%，表明样品供试品溶液在室温条件下放置24 h稳定性良好。

2.6.3 重复性试验：称取广东紫珠样品(批号：190816)粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按上述已建立的方法分别制备供试品溶液并进样测定，记录5种待测成分峰面积并计算6次测定的平均含量和RSD。结果显示，连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素平均含量分别为7.84、6.88、1.29、0.09和0.20 mg/g，6次测定的RSD分别为0.98%、0.81%、1.01%、0.88%和0.85%(n=6)，表明建立的方法的重复性良好。

2.6.4 加样回收率试验：称取广东紫珠(批号：190816)粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入新配置对照品溶液，按上述已建立的方法分别制备供试品溶液并进样测定，计算5种待测成分平均加样回收率。结果显示，连翘酯苷B平均加样回收率为99.59%，RSD为1.04%；木犀草苷平均加样回收率为100.20%，RSD为2.30%；金石蚕苷平均加样回收率为98.98%，RSD为1.51%；毛蕊花糖苷平均加样回收率为99.05%，RSD为2.04%；木犀草素平均加样回收率为99.83%，RSD为1.87%，表明建立的含量测定方法准确度高，见表2。

表2 加样回收率测定结果Tab 2 Results of recovery rate

2.7 样品的测定

取8个不同采收批次(采收时间自2019年8月至2019年11月)的广东紫珠样品，分别按上述已建立的方法制备供试品溶液并进样测定，记录各样品峰面积，以外标法计算连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5种成分的平均含量，见表3。

表3 样品的含量测定结果(n=3，mg/g)Tab 3 Content determination results of samples (n=3,mg/g)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的确定

提取溶剂、提取方法和提取时间对药材中有效成分溶出提取均有较大影响。本实验在前期对提取条件进行了优化，分别考察了料液比、提取溶剂、提取方法以及提取时间对5种成分提取率的影响，结果提示，料液比为1 ∶ 50、以70%甲醇为提取溶剂、超声处理30 min对5种待测成分综合提取效率最高。

3.2 检测波长的选择

参照已有的文献报道，连翘酯苷B、金石蚕苷和毛蕊花糖苷最大吸收波长在330 nm附近，木犀草苷和木犀草素最大吸收波长在350 nm附近[20-22]。对供试品和对照品进行全波长(190～400 nm)光谱扫描，发现检测波长取330 nm时，5种待测成分色谱峰基线较平稳、分离效果好、响应值均较大，能较好反映样品中5种待测成分的含量信息，故本方法最终采用330 nm为检测波长。

3.3 柱温的选择

柱温对色谱保留时间、分离度及峰形均有不同程度的影响，较高的柱温可有效缩短色谱峰保留时间和降低峰宽，从而缩短分析时间、提高待测成分信噪比。本实验考察了室温至45 ℃范围内不同温度对5种待测成分分离测定效果的影响。结果显示，柱温取35 ℃最优，5种待测成分保留时间适中，色谱峰形良好、信噪比较高且与相邻色谱峰均能有效分离。

3.4 测定结果分析

黄酮类与苯丙素类成分为广东紫珠的主要化学成分，含量丰富，且具有较为显著的药理活性，是评价广东紫珠药用价值与质量控制的重要指标[11-15]。《中华人民共和国药典：一部》(2020年版)中，广东紫珠仅以连翘酯苷B和金石蚕苷含量为药材质量控制指标，中药具有整体性、多组分、多靶点的特点，仅以上述2种成分作为广东紫珠的质量控制标准相对不够全面，所以本实验考察了广西桂林市同一种植基地中不同采收期广东紫珠中连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5种有效成分的含量，结果显示，8—11月采收的8批次广东紫珠中连翘酯苷B及金石蚕苷总量均能满足现行《中华人民共和国药典：一部》(2020年版)的要求(两者总量≥0.5%)，说明广东紫珠在8—11月时间段采收均能满足入药要求。比较5种待测成分在广东紫珠中的含量，发现5种成分在广东紫珠中的含量差异较大，广东紫珠不同采收期5种成分含量从高到低均为连翘酯苷B>金石蚕苷>毛蕊花糖苷>木犀草素>木犀草苷，故当前《中华人民共和国药典》选择连翘酯苷和金石蚕苷为质控指标。比较5种有效成分不同采收期的含量，结果显示，5种有效成分含量在8—11月均先升高后降低，其中连翘酯苷B、金石蚕苷和毛蕊花糖苷在10月中下旬含量最高，木犀草苷和木犀草素在9月下旬含量最高，按照当前《中华人民共和国药典》质控标准要求，最佳采收期可为10月份。

本实验建立的测定广东紫珠中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、木犀草苷和木犀草素5种主要有效成分的HPLC法的科学性、准确性、简便性和准确度均能较好地满足科研和生产需求，可为广东紫珠质控标准的进一步提升提供一定的参考依据。