母鼠子痫前期炎症刺激致子鼠肾脏发育不良的作用机制研究

白 莹，孙静莉

子痫前期在全球范围内发病率为3%～5%，严重威胁母婴健康[1-3]。该病主要表现为妊娠20周后出现高血压伴蛋白尿，合并多器官损伤[4-6]。母体妊娠期间的炎症免疫反应是导致胎儿肾脏疾病的重要原因之一[7-8]。孕鼠子痫前期细胞因子释放增加，影响胎鼠神经内分泌免疫系统，导致子代大鼠肾脏疾病，分析二者之间的关系，可能为预防胎鼠肾脏病变提供参考[9-10]。母鼠子痫前期炎症免疫通过肾素-血管紧张素系统(RAS)影响胎鼠，导致胎鼠发育不良，尤其对胎鼠肾脏的发育影响最为关键[11]。但是目前已有的研究尚不完善，因此我们通过观察母鼠子痫前期炎症刺激状态，探究其对子代肾脏发育不良的影响。

1 资料与方法

1.1孕鼠模型的建立 健康成年SD大鼠，体质量200～250 g。饲养屏障环境设施中，饲养管理人员是受过训练的专业人员。成年雄性和雌性大鼠交配每笼1∶4，室温(24±1)℃，用于孕鼠模型建立。第2天7:00和19:00，对雌性大鼠进行检查，以确定模型是否制备成功。阴道或阴道涂片阳性为孕0 d。将未孕雌性大鼠作为空白组(n=12)。本研究通过我院实验动物管理和使用批准。

1.2分组及处理 将24只孕鼠随机均分为模型组和对照组，妊娠第10天，模型组给予左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，美国sigma公司)125 mg/(kg·d)皮下注射至妊娠第19天。对照组等时等量皮下注射生理盐水。空白组不做处理。妊娠第20天检测大鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白，子痫早期模型制备成功标准为血压升高>30 mmHg[12]。子鼠出生后由母鼠喂养30 d，每组随机挑选2只子鼠(一雌一雄)，雌雄分笼饲养，定期喂养，自由饮水。笼内环境和饲养条件相同。处死各组实验大鼠和子鼠，收集组织样本。

1.3观察指标

1.3.124 h尿蛋白检测[13]：清晨8：00，将1月龄子鼠放入代谢笼中，可自由活动、饮食，次日清晨收集尿液，采用全自动生化仪测定尿蛋白浓度。

1.3.2肾功能和炎性因子测定：母鼠及子鼠均采用尾尖采血。将大鼠固定好，鼠尾置于45～50 ℃热水中浸泡数分钟或用乙醇反复擦拭消毒、扩张尾静脉血管，擦干鼠尾备好取血位置。在大鼠尾尖5～10 mm处用剪刀剪下，按摩尾根至尾尖，将大鼠血液置于枸橼酸钠抗凝试管中，取血1～3 ml。取血后注意保护伤口。血样离心分离上清，-80 ℃保存待检。采用CX-7全自动生化分析仪(美国贝克曼)，测定血清肌酐(Scr)和尿素(BUN)水平。ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和C反应蛋白(CRP)水平。

1.4肾脏组织获取及HE染色 子鼠喂养30 d后处死。处理方法：乙醚麻醉后用力抓大鼠背部牵拉，按住大鼠头部，脊髓和大脑断裂死亡，立即称重。暴露腹部，小心分离子鼠肾脏。将取出的组织蒸馏水冲洗后固定，石蜡包埋切片，厚度5 μm，置于载玻片，并标记，烘烤干燥。采用HE染色方法，染色步骤同HOCHSTIM等[14]研究中提及的方法，于光镜下观察肾脏形态并采集典型病变图像。

1.5qRT-PCR检测肾素(Renin)、血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素(Ang)mRNA表达情况 取子鼠肾脏组织捣碎，依次加入1 ml TRIzol裂解液(剧烈振荡)，加入0.2 ml氯仿(离心取上清)，加入70%乙醇(振荡混匀)，提取纯化组织RNA，将浓度和纯度合格的RNA保存于-80 ℃备用，防止降解。参照qRT-PCR试剂盒(Invitrogen货号：11752-050)进行逆转录。引物(北京擎科生物)设计序列(5 '-3 ')：Renin Sense：GGGTGCTAAAGGAGGAAGTGTT，Antisense：AGTGAAAGTTGCCCTGGTAATG；ACE Sense：TCCACCGTTACCAGACAACTATCC，Antisense：CTGCGTATTCGTTCCACAACACCT；Ang Sense：CTGGAGCTAAAGGACACACAGA，Antisense：CAGGGTCTTCTCATCCACGG；β-actin Sense：CTTCCTTCCTGGGTATGGAATC，Antisense：CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT。qRT-PCR仪(美国life technologies公司),95 ℃预变性2 min；40个循环：95 ℃变性，60 ℃退火，72 ℃延伸。扩增结束计算待测目的基因Ct值，重复3次。

1.6Western Blotting检测Renin、ACE和Ang蛋白表达情况 采用T-PER(Thermo Pierce公司)提取试剂盒进行总蛋白的提取。在8%～12%分离胶中以80 V电泳2 h，在5%浓缩胶中以60 V电泳2 h。甲醇浸泡适宜大小的PVDF膜10 min后，100 V恒压全湿转膜2 h，室温封闭1 h。一抗稀释后在4 ℃冰箱孵育过夜，常温孵育二抗2 h；曝光后分析蛋白条带光密度值，重复3次。

2 结果

2.13组大鼠炎性因子水平比较 3组大鼠精神状态、活动度、食欲及生存情况良好。与对照组和空白组比较，模型组TNF-α、IL-6和CRP水平均显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠炎性因子水平比较

2.2子鼠肾功能指标比较 与对照组比较，模型组子鼠血清BUN、Scr和尿蛋白水平均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 2组子鼠肾功能指标比较

2.3子鼠肾脏形态 对照组子鼠肾脏组织结构清晰，肾小球正常，无炎性细胞浸润，无明显病变；模型组子鼠肾小管上皮细胞肿胀，变性坏死，肾小球毛细血管充血，结构出现紊乱，肾小管管腔变窄，有炎性细胞浸润。见图1。

图1 2组子鼠肾脏病理形态HE染色结果

2.4子鼠肾脏组织中Renin、ACE、Ang mRNA表达情况 与对照组比较，模型组Renin、ACE和Ang mRNA表达水平均明显升高(P<0.05，P<0.01)。见图2。

图2 2组子鼠肾脏RAS系统相关基因表达水平

2.5子鼠肾脏组织Renin、ACE、Ang蛋白表达情况 与对照组比较，模型组Renin、ACE和Ang蛋白表达水平高于对照组(P<0.05，P<0.01)。见图3。

图3 2组子鼠肾脏RAS系统相关蛋白表达情况

3 讨论

子痫前期即是糖、脂代谢和血管功能的应激反应失败，与子代多种器官疾病发生有关[15-18]。最近研究发现，炎性细胞可以诱导肾脏的炎症反应[19-21]。母体炎症水平的异常改变，会对胎儿的肾脏发育产生一定不良影响[22]。RAS能调节肾功能，维持水盐代谢平衡，同时调节组织生长和发育[23]。目前，晚期慢性肾脏病除了透析治疗外，缺乏其他有效的治疗方法[24]。所以我们应该寻求肾脏疾病早期防治的方法，关注母体疾病所致子代肾脏疾病的研究。

本研究采用SD成年健康雌性大鼠建立子痫前期孕鼠模型。建模大鼠精神状态、活动度、食欲及生存情况良好。本研究发现，模型组大鼠炎性因子水平较对照组和空白组升高，而其子鼠血清BUN、Scr和尿蛋白水平较对照组显著升高。提示生理盐水处理对孕鼠炎症水平无显著影响，而子痫前期孕鼠的子代伴有明显的肾脏损伤，说明子痫前期孕鼠的炎症反应增强，对子鼠肾脏有明显损伤作用。国外研究表明，孕妇血清炎性因子与肾脏功能和子宫内膜厚度呈正相关，提示孕期炎症是母体肾病及子代肾功能发育不全的危险因素[25]。研究表明，子代大鼠RAS系统激活，可导致肾小球滤过率和肌酐清除率降低[26]。进一步研究表明，母体孕期炎症途径激活后，会引起子代肾脏发生结构及功能变化[27]。本研究结果与文献报道一致。本研究结果显示，模型组子鼠肾小管上皮细胞坏死，毛细血管充血，结构出现紊乱，肾小管管腔变窄，有炎性细胞浸润，可能与母体炎症刺激，导致胚胎发育环境改变，胎鼠肾脏发育时受到低炎症刺激，影响肾脏的发育。

RAS系统在肾脏发育中有至关重要的作用。研究表明，任何原因，包括使用药物或基因敲除技术均能影响肾脏RAS系统及肾脏形态和功能[28]。本研究结果与文献基本一致。国内外其他研究也表明，RAS系统的所有成分均在肾脏组织中表达[29]。肾脏RAS系统活性最高[30]。本研究结果显示，子代大鼠1月龄时，模型组RAS系统Renin、ACE和Ang mRNA及蛋白水平高于对照组。与杨晓静[31]和陶荷花等[32]研究结果一致。考虑由于孕鼠子痫前期的炎症水平增高，抑制了胎鼠RAS活性，从而导致孕期肾脏发育异常，子鼠娩出后，肾功能受损。

综上所述，子痫前期孕鼠体内高炎症水平可以激活胎鼠RAS系统影响肾脏功能。本研究样本量较小，存在统计误差，有待进一步研究。