百令胶囊联合还原型谷胱甘肽保护单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化的机制探究

朱戈丽，李菊霜，喻业安，封宝红，毕智敏，伍 军

每年因慢性肾脏病发展为终末期肾病的患者数持续增加[1]。慢性肾脏病发病早期症状较为隐匿，且病情轻微，易被患者忽视，是终末期肾病发病率持续增长的原因[2]。肾纤维化是慢性肾脏病进入终末期的主要病理基础，且纤维化程度与肾功能水平密切相关[3]。故改善肾纤维化是降低终末期肾病发生的重要环节。据报道，百令胶囊联合还原型谷胱甘肽可明显改善单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾纤维化[4]，但其潜在作用途径尚不清楚。百令胶囊常作为天然虫草的代用品，具有保护肝肾功能、拮抗氧自由基的作用[5]。还原型谷胱甘肽可发挥抗脂质过氧化作用以减轻自由基损伤[6]。本研究从氧化应激方面着手，探究百令胶囊联合还原型谷胱甘肽保护UUO模型大鼠肾纤维化的机制，以期为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 清洁级SD大鼠40只，雄性，体质量220～260 g，8周龄，由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(鄂)2017-0012。将大鼠随机分为假手术组、UUO组、还原型谷胱甘肽组及百令胶囊联合还原型谷胱甘肽组(联合组)，每组10只。

1.2UUO模型构建[7]与给药 各组大鼠禁食、禁水12 h，麻醉后于左侧腹部偏下处切开，逐层打开腹腔，游离出跨过左侧髂血管的左侧输尿管，除假手术组外的其他组大鼠于左侧输尿管肾盂结合处及向下1 cm处完全结扎，再逐层缝合关闭腹腔。于造模前1 d至术后第9日还原型谷胱甘肽组予还原型谷胱甘肽(重庆药友制药有限责任公司，国药准字H2010093)300 mg/kg灌胃，联合组予百令胶囊(杭州中美华东制药有限公司，国药准字Z10910036)1.5 g/kg和还原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃，每日1次。假手术组和UUO组予等量生理盐水。

1.3检测指标及方法 给药结束后，称量大鼠体质量，注射戊巴比妥麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清采用全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)和尿素(BUN)。剪取左侧肾组织，称梗阻侧肾脏湿重，计算肾脏指数[梗阻侧肾脏湿重/体质量×100%]。经左侧肾脏冠状面剪取部分肾组织固定于甲醛溶液制备石蜡切片，分别行常规HE染色和Masson染色，观察大鼠肾组织病理变化。剪取肾皮质，混入预冷生理盐水制备组织匀浆液，采用ELISA法检测活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。剩余肾组织添加RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白定量后行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再电转至聚偏二氟乙烯膜，经5%脱脂牛奶室温封闭后分别添加兔抗Nrf2、Keap1多克隆抗体及小鼠抗β-actin单克隆抗体，4 ℃过夜孵育，1︰1000稀释，TBST洗膜5次，每次8 min，再加入二抗室温孵育1 h，1︰5000稀释，TBST洗膜5次，每次8 min，最后显影曝光。扫描X线片条带，使用Image J软件测定条带灰度值，目的蛋白与β-actin蛋白灰度值表示该目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾功能的影响 与假手术组比较，UUO组血清Scr、BUN和梗阻侧肾脏指数明显升高(P<0.05)；与UUO组比较，还原型谷胱甘肽组和联合组Scr、BUN和梗阻侧肾脏指数明显降低，且联合组降低效果更显著(P<0.05)。见表1。

表1 百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾功能的影响

2.2百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾组织病理形态的影响 HE染色显示，假手术组肾组织细胞结构正常；UUO组肾小管扩张、上皮细胞肿胀明显，伴空泡征和大量炎性细胞浸润；还原型谷胱甘肽组和联合组上述病理改变明显减轻。Masson染色显示，假手术组基本无蓝色胶原纤维，UUO组肾间质存在大量的蓝色胶原纤维，还原型谷胱甘肽组和联合组胶原纤维量明显减少。

2.3百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾组织氧化应激的影响 与假手术组比较，UUO组肾组织匀浆液中ROS和MDA含量明显升高，SOD含量明显降低(P<0.05)；与UUO组比较，还原型谷胱甘肽组和联合组ROS和MDA含量明显降低，SOD含量明显升高，且联合组改善效果优于还原型谷胱甘肽组(P<0.05)。见表2。

表2 百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾组织氧化应激的影响

2.4百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾组织Nrf2和Keap1蛋白表达的影响 与假手术组比较，UUO组肾组织中Nrf2蛋白表达明显降低，Keap1蛋白表达明显升高(P<0.05)；与UUO组比较，还原型谷胱甘肽组和联合组Nrf2蛋白表达明显升高，Keap1蛋白表达明显降低，且联合组改善效果优于还原型谷胱甘肽组(P<0.05)。见表3。

表3 百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对UUO大鼠肾组织Nrf2和Keap1蛋白表达的影响

3 讨论

目前，慢性肾脏病的治疗多采用多模式治疗，包括应用阻断肾素-血管紧张素系统、严格控制血压血糖药物等，但目前终末期肾病的逆转效果仍十分有限[8]。故迫切需要更为有效的治疗方法，减缓或阻止慢性肾脏病的进展。尿路阻塞导致肾肿大，尿液聚集于肾盂或肾盏，肾结构会出现进行性损伤，从而引起慢性肾功能障碍。随着肾血流量、肾小球滤过率逐渐降低，肾实质损伤也进一步加重，肾小管萎缩和细胞外基质沉积，这将加速肾纤维化[9]。故UUO是研究肾纤维化的理想模式。本研究结果显示，UUO大鼠梗阻侧肾脏出现明显水肿，肾小管间质损伤严重，并伴明显纤维化，肾功能也出现明显障碍，提示UUO大鼠模型构建成功。

百令胶囊可补肺肾、益精气，常用于肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、慢性肾功能不全的辅助治疗[10-13]。于文会等[14]发现，联用氯沙坦钾片和百令胶囊治疗慢性肾脏病可以改善患者肾功能，减轻肾小球硬化，延缓肾纤维化。还原型谷胱甘肽主要由肝脏合成，可与体内过氧化物和自由基结合，保护细胞中含巯基的蛋白质和酶，可参与多种外源性、内源性有毒物质的减毒反应[15-16]。许诚楷等[17]发现，应用还原型谷胱甘肽治疗可显著改善早期糖尿病慢性肾脏病患者免疫功能、氧化应激水平，减少异常新生血管生成。百令胶囊加还原型谷胱甘肽含药血清可能通过抑制TGF-β1/Smad表达,抑制肾纤维化[18]。本研究显示，百令胶囊联合还原型谷胱甘肽治疗后大鼠肾组织病理损伤和肾纤维化程度明显减轻，肾功能也有明显改善，与上述研究结果相符。

氧化应激在肾纤维化的发生发展中起重要作用，过度分泌ROS可氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，致肾功能损伤[19-20]。本研究结果显示，UUO大鼠ROS和MDA含量明显升高，SOD含量明显下降，经百令胶囊联合还原型谷胱甘肽治疗后，ROS和MDA含量明显下降，SOD含量明显升高，提示百令胶囊联合还原型谷胱甘肽可能通过降低氧化应激水平，改善UUO大鼠肾纤维化。Nrf2是调节抗氧化应激反应的转录因子，而Keap1是Nrf2特异性受体，正常状态下Nrf2与Keap1形成聚合物处于无活性状态，氧化应激刺激下聚合物解离启动抗氧化反应元件[21]。大量研究显示，调控Nrf2/Keap1信号通路，可能是改善肾损伤的潜在作用途径[22]。本研究UUO大鼠肾组织中Nrf2表达下调，Keap1表达上调，给予百令胶囊联合还原型谷胱甘肽干预后Nrf2表达上调，Keap1表达下调，提示百令胶囊联合还原型谷胱甘肽可能通过调节Nrf2/Keap1信号通路，降低氧化应激水平，发挥对UUO大鼠肾纤维化保护作用。

综上，百令胶囊联合还原型谷胱甘肽可明显减轻UUO大鼠肾纤维化，可能与通过调节Nrf2/Keap1信号通路减轻氧化应激有关。