共培养时酿酒酵母对速生梭菌己酸代谢的影响及其机理

晋湘宜，赵 婷，王家胜，李 良，李俊薇，陈茂彬，方尚玲,*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.黄鹤楼酒业有限公司，湖北 武汉 430050）

己酸菌是经培养能够生成己酸的一类微生物的统称。目前从浓香型白酒窖泥中筛选出的己酸菌主要是以乙醇为底物合成己酸的微生物，如克氏梭菌（）、速生梭菌（）、酪酸梭菌（），以及以乳酸为底物合成己酸的微生物，如瘤胃菌（Ruminococcaceae）。近几年朱晓军等也从窖泥中分离出1 株葡萄糖营养型的己酸菌，属于瘤胃球菌科梭菌属。

浓香型白酒的生产是多种微生物协同作用的过程，酵母是完成乙醇发酵的主体微生物，己酸菌利用酵母代谢生成的乙醇及其他微生物生成的有机酸合成己酸，己酸与乙醇酯化形成浓香型白酒的特征风味物质己酸乙酯。研究己酸菌与酵母之间的相互作用对探究浓香型白酒发酵机理有重大意义。浓香型白酒的生产是利用高粱等谷物原料边糖化边发酵的过程，谷物原料经蒸煮糊化后拌曲入窖池密封发酵。随着发酵过程的进行，酒醅中的淀粉、葡萄糖、乙醇、有机酸等物质渗入窖泥，为窖泥中的微生物补充生长所需的营养成分。在不同营养条件下研究酿酒酵母（）对己酸菌己酸代谢的影响，更接近两种微生物在窖池中的实际情况，有助于解析浓香型白酒实际生产过程中己酸菌与酵母的代谢情况。

目前关于己酸菌与酵母间互作关系的研究主要集中于己酸菌代谢产物对的影响、添加对己酸菌产酸的影响等方面。而针对不同碳源条件下对己酸菌的影响及其机理的研究较少。以实验室前期从窖泥中筛选得到的1 株可产己酸的JSJ-1和C-1为研究对象，在葡萄糖为唯一碳源和乙醇、葡萄糖为碳源这2 种营养条件下，比较2 种微生物纯培养、共培养过程中生长代谢（菌落数、葡萄糖、乙醇、丁酸、己酸）的差异，分析对己酸菌己酸代谢的影响及其机理，旨在对浓香型白酒的发酵过程有更加深入的认识，为进一步优化发酵工艺提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

分离自浓香型白酒厂优质老窖泥，命名为JSJ-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020881；命名为C-1，实验室筛选并保藏。

1.1.2 培养基

乙醇乙酸钠（sodium ethyl acetate，ES）培养基：酵母膏1 g、无水乙酸钠0.5 g、硫酸铵0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸馏水100 mL，灭菌后加入无水乙醇2 mL、干热灭菌后CaCO1 g。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、水100 mL。

复合培养基A：葡萄糖4 g、酵母膏1 g、无水乙酸钠0.5 g、硫酸铵0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸馏水100 mL。

复合培养基B：葡萄糖0.5 g、酵母膏1 g、无水乙酸钠0.5 g、硫酸铵0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸馏水100 mL。灭菌后加入无水乙醇2 mL、干热灭菌后的CaCO1 g。

1.1.3 试剂

酵母膏、无水乙酸钠、无水硫酸钠、无水乙醇、葡萄糖、CaCO、氯化钠、硫酸铵、MgSO·7HO、KHPO、二氯甲烷（均为分析纯），乙酸、丁酸、己酸（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；2.5 L圆底立式厌氧培养袋 青岛高新技术产业园海博生物科技有限公司；厌氧产气袋 日本三菱公司。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱 上海智城分析仪器有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；WFJ 2000分光光度计 江苏海门市麒麟医用仪器厂；5977B-7890B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；SBA-40D生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

JSJ-1种子液的制备：JSJ-1种子液的培养使用18 mm×180 mm的试管，装液量为30 mL。将JSJ-1斜面接种到ES培养基，用封口膜密封，34 ℃静置培养7 d。

C-1种子液的制备：将C-1斜面接种到装有YPD液体培养基的三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min的摇床中培养16 h。

1.3.2 不同营养条件下C-1对JSJ-1生长及代谢的影响

1.3.2.1 葡萄糖为碳源

在ES培养基的基础上使用不同用量葡萄糖替换乙醇，葡萄糖质量分数分别设置为1%、2%、3%、4%、5%。将接种到培养基中培养3 d，检测乙醇含量。根据前期实验结果，乙醇添加量为体积分数2%时最适合产己酸。故选择C-1发酵3 d乙醇约为16 g/L的葡萄糖含量作为下一步C-1与JSJ-1共同培养时培养基中葡萄糖含量，培养基命名为复合培养基A。然后在此培养基中将C-1与JSJ-1种子液按体积比2∶1同时接入，总接种量为5%。C-1与JSJ-1相同情况下单独培养作为对照组。培养条件均同己酸菌种子液的培养。培养9 d，定期取样检测。

1.3.2.2 葡萄糖和乙醇为碳源

为探究在葡萄糖和乙醇同时存在时，C-1除提供底物和消耗氧气外对JSJ-1的生长代谢是否还存在其他影响。在ES培养基基础上添加0.5%葡萄糖作为共培养培养基，命名为复合培养基B。

由交叉划线观察C-1对JSJ-1生长的影响：在复合培养基B固体平板上，将JSJ-1和C-1分别采用不同的划线顺序接种，34 ℃厌氧培养4 d后观察两种菌的生长情况。将接种好的平板倒置放入2.5 L厌氧培养袋，放入1 包厌氧产气袋，迅速密封提供厌氧环境。

液体共培养探究C-1对JSJ-1生长及代谢的影响：将培养好的JSJ-1种子液与C-1种子液按体积比为1∶2同时接种到复合培养基B，接种量为5%。C-1与JSJ-1相同条件下分别单独培养作为对照组。培养条件均同JSJ-1种子液的培养。培养12 d，定期取样检测。

1.3.3 菌落数的测定

定期取发酵液，用生理盐水梯度稀释后取100 μL涂布于复合培养基B固体平板上，倒置装入2.5 L立式厌氧培养袋，加入1 包厌氧产气袋，迅速密封。置于培养箱内，34 ℃培养4 d，分别记录C-1与JSJ-1的菌落数。

1.3.4 有机酸的定量测定

有机酸测定采用液液微萃取-气相色谱-质谱联用法。液液微萃取：取200 μL发酵液，然后加入100 μL 2%稀硫酸将pH值调至约为2，加入2 mL二氯甲烷，使用涡旋振荡仪充分振荡，静置30 min待溶液分层。将上层发酵液吸出，然后加入过量无水硫酸钠，在-80 ℃冰箱放置4 h除去水分。然后使用0.22 μm有机滤膜过滤，每毫升发酵液中加入20 μL内标溶液，装入进样瓶自动进样。内标溶液为18.18 g/L的2-乙基丁酸溶液。

气相色谱条件：DB-Wax石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），初始柱温为45 ℃，保留1.5 min，以6 ℃/min升温至85 ℃，保持0 min，再以4 ℃/min升温至115 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升温至190 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升温至225 ℃，保持3 min，进样口温度260 ℃，载气为氦气（He）（99.999%），载气流量为10.7 mL/min，分流进样，分流比10∶1，溶剂延迟5 min。

质谱条件：离子源为电子电离源，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，电子能量为70 eV，发射电流为34.6 μA，倍增器电压为1 294 V；接口温度为280 ℃，质量范围为/50～600，对采集到的质谱图根据化合物峰离子对照NEST数据库检索定性。

1.3.5 乙醇与葡萄糖的测定

采用生物传感分析仪检测。

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism 8对数据进行处理和作图分析，使用CorelDRAW 2019对图片进行处理和组合。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖为碳源S. cerevisiae C-1对C. celerecrescens JSJ-1生长及代谢的影响

在浓香型白酒的生产过程中，一般认为对己酸菌的影响主要为生成的乙醇为己酸菌提供合成己酸的底物，另外前期利用氧气进行生长可以为己酸菌生长创造有利的环境。故在培养基中唯一碳源为葡萄糖时同时接种和己酸菌，验证利用葡萄糖生成的乙醇可为己酸的合成提供底物。

图1 不同葡萄糖添加量条件下乙醇的生成情况Fig. 1 Ethanol production at different glucose concentrations in the medium

如图1所示，当葡萄糖添加量为4%时，C-1静置培养3 d乙醇质量浓度为15.6 g/L，最接近JSJ-1产己酸的最佳乙醇添加量。故将复合培养基A中葡萄糖设置为4%。

图2 葡萄糖为碳源时S. cerevisiae C-1对C. celerecrescens JSJ-1生长及代谢的影响Fig. 2 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose as the carbon source

如图2所示，JSJ-1在4%葡萄糖为碳源的复合培养基A单独培养时，利用了少量的葡萄糖用于生长，生成某些酸性物质引起pH值迅速下降，未生成己酸。C-1单独培养时，葡萄糖在第3天已被完全利用，生成了乙醇，后期乙醇含量几乎不变，未生成己酸。当JSJ-1与C-1共同培养时，葡萄糖含量变化趋势与C-1单独培养时相同，乙醇含量在第3天最高，第6天开始下降，同时对应己酸的生成。这与己酸菌合成己酸的逆β氧化途径相符，己酸菌利用乙醇生成乙酰辅酶A，然后通过碳链的延伸依次生成丁酸和己酸。说明当葡萄糖为唯一碳源时，C-1可将葡萄糖转化为乙醇，为JSJ-1提供合成己酸的底物。

2.2 葡萄糖和乙醇同时存在S. cerevisiae C-1对C. celerecrescens JSJ-1生长及代谢的影响

2.2.1 交叉划线观察

图3 C. celerecrescens JSJ-1与S. cerevisiae C-1的交叉划线结果Fig. 3 Cross-streaking results of C. celerecrescens JSJ-1 and S. cerevisiae C-1

在置于厌氧培养袋内的固体复合培养基B上34 ℃培养，JSJ-1菌落呈浅褐半透明状，C-1菌落呈白色。根据图3A，当JSJ-1先划线C-1后划线时，C-1与JSJ-1接触后的后半段肉眼观察到的菌落仍然是酵母菌，未观察到JSJ-1；由图3B可以看出，当C-1先划线至平板，JSJ-1后划线时，交叉点的后半段观察到菌落为C-1而不是JSJ-1。当划线至与C-1的交叉点后，接种环上既有JSJ-1也有C-1。JSJ-1为可耐受一定氧气的厌氧菌，而C-1为兼性厌氧，较JSJ-1而言生长速度更快，所以会优先利用营养物质。这说明，此培养条件下，两种微生物同时接种，C-1比JSJ-1更具有生长优势，会占据主要地位。

2.2.2 液体共培养

如图4A所示，JSJ-1单独培养时丁酸质量浓度在前7 d几乎不变，第8～10天迅速上升至约2 g/L，之后开始下降。共培养时丁酸质量浓度在前2 d迅速上升至约2 g/L，之后开始下降。共培养时丁酸的生成及下降均早于JSJ-1在复合培养基中单独培养。

如图4B所示，当JSJ-1单独培养时，第8天开始生成己酸，第12天己酸产量达9.70 g/L。C-1与JSJ-1共同培养时，己酸在第4天开始生成，第12天己酸产量为9.64 g/L。C-1与JSJ-1共同培养相比JSJ-1单独培养使己酸生成时间提前了4 d，发酵12 d己酸产量相差不大。根据己酸菌利用乙醇生成己酸的逆β氧化途径，6分子乙醇氧化生成1分子乙酸，另外5分子生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A与乙酸结合生成丁酸，丁酸再与乙酰辅酶A结合生成己酸。丁酸是合成己酸的中间产物，说明己酸菌与共培养可以促进己酸的生成。

由图4C可知，C-1在复合培养基B中单独培养时，乙醇含量并未升高，反而略有下降，可能由于培养基中葡萄糖含量偏低，主要被用来供C-1进行生长和繁殖，没有多余的葡萄糖代谢生成乙醇。C-1单独培养时，乙醇下降的原因主要为培养过程中挥发损失。JSJ-1与C-1共培养时乙醇含量也一直处于下降趋势。可见，在复合培养基B中JSJ-1与C-1共培养时丁酸及己酸生成的提前并不是由于C-1利用葡萄糖生成了乙醇为JSJ-1提供底物。

由图4D、E可以看出，当JSJ-1与C-1液体共培养时，第1天生长的菌落主要为C-1，葡萄糖在第1天基本耗尽，C-1的菌体量第1天最高，之后持续下降。JSJ-1的菌落数在第2天开始缓慢增长，第5天时数量最高，之后缓慢下降。这与平板交叉划线得出的结论一致，在复合培养基中，C-1比JSJ-1更占据生长优势，会优先生长，培养基中的葡萄糖主要是被C-1消耗用于生长和繁殖。

由前期实验得知，葡萄糖对JSJ-1产己酸有抑制作用，会使己酸的生成延迟。当JSJ-1与C-1在液体复合培养基共培养时，C-1占据生长优势，会利用大部分的葡萄糖，缓解JSJ-1利用葡萄糖对产己酸的抑制作用，从而使丁酸、己酸的生成时间提前。

图4 葡萄糖和乙醇为碳源时S. cerevisiae C-1对C. celerecrescens JSJ-1生长及代谢的影响Fig. 4 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose and ethanol as the carbon source

3 结 论

在葡萄糖为碳源和乙醇、葡萄糖为碳源这2 种营养条件下探究了C-1对JSJ-1己酸代谢的影响。在葡萄糖为唯一碳源时，C-1利用葡萄糖生成乙醇，为JSJ-1提供合成己酸的底物。在乙醇与葡萄糖同时存在时，由于C-1比JSJ-1更具有生长优势，会优先利用葡萄糖进行生长繁殖，缓解葡萄糖对己酸菌产己酸的抑制作用。本研究确定了共培养时对己酸菌的影响及其机理，对浓香型白酒酿造过程中两种微生物间的相互作用机制有了更清晰的认识，可为后续将与己酸菌复配应用于窖池养护提供重要参考依据。