高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法研究塑料接触材料中酚类化合物向奶油中的迁移

张 慧，曹 慧，姜 侃，肖功年，王 瑾，周学军，厉小燕

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023；2.浙江省产品质量安全科学研究院，浙江 杭州 310018）

食品中双酚类和烷基酚类等酚类化合物的污染一直是人们关注的领域。在对各类食品的调查中酚类化合物如双酚A（bisphenol A，BPA）、双酚S（bisphenol S，BPS）和壬基酚（nonylphenol，NP）等仍有一定的检出率。这些物质可产生类似雌激素的作用而干扰人体内分泌系统，影响人体健康。食品中酚类化合物主要来源于环境污染和接触材料的迁移等。酚类化合物常用作环氧树脂等高分子材料或包装容器内壁涂层生产中的化工原料或中间体，通过材料和食品直接接触，在生产或贮存过程中可能会迁移到食品中。国家标准规定食品接触用塑料树脂、涂料和涂层中BPA和BPS的特定迁移量分别为0.6 mg/kg和0.05 mg/kg，还没有食品中双酚类和烷基酚类的限量标准。

近年来，裱花蛋糕塑料装饰品如各种造型的插件等时常被用于蛋糕表面的点缀和美化，由于色彩鲜艳、种类繁多受到青少年的喜爱。塑料装饰品一般摆放在裱花蛋糕的奶油表面而与奶油直接接触，接触材料中的酚类化合物可能会迁移至奶油中产生食品安全风险。一些地区已经禁止在裱花蛋糕上使用塑料装饰品。因此，酚类化合物的迁移研究至关重要。当前的研究多是食品接触材料往模拟液中的迁移，而往真实样品中的迁移研究则较少。

酚类化合物的检测方法有分光光度法、荧光光度法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、高分辨质谱法、酶联免疫法等，样品涉及食品模拟液（水性食品、含酒精食品和含油脂食品等模拟液）、食品、饮用水、纺织品等。前人多是针对某几类酚类物质的检测研究，尚缺乏奶油中多种酚类化合物同时检测的方法。

本实验建立高效液相色谱-三重四极杆串联质谱技术同时测定奶油中14 种酚类化合物的检测方法，尝试研究塑料接触材料中酚类化合物在真实奶油中的迁移情况，并对市售的裱花蛋糕装饰摆件等进行迁移量的检测分析，为食品安全风险评估和科学监管提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

动物淡奶油、植物奶油样品、塑料蛋糕装饰摆件、底托配件、插杆 市购。

BPA标准品（纯度＞98%） 上海安谱实验科技股份有限公司；BPS、双酚E（bisphenol E，BPE）、双酚F（bisphenol F，BPF）、4-正辛基酚（4--octylphenol，4--OP）、4-壬基酚（4-nonylphenol，4-NP）、4-正壬基酚（4--nonylphenol，4--NP）标准品（纯度＞99%） 北京Bepure公司；双酚B（bisphenol B，BPB）、双酚AF（bisphenol AF，BPAF）、双酚AP（bisphenol AP，BPAP）标准品（纯度＞98%）美国TRC公司；双酚Z（bisphenol Z，BPZ）标准品（纯度＞99%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；四溴双酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）（纯度＞99%） 美国Chem Service公司；四氯双酚A（tetrachlorobisphenol A，TCBPA）、辛基酚（octylphenol，OP）标准品（纯度＞99%） 美国AccuStandard公司；乙腈、甲醇、正己烷（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

5500QTRAP型三重四极杆串联质谱仪 美国AB SCIEX公司；LC 20AD高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；FA2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；VORTEX2旋涡混合器 德国IKA公司；UNIVERSAL 320 R离心机德国Hettich科学仪器有限公司；GT-7005-AT2恒温恒湿试验机 高特威尔检测仪器（青岛）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仪器工作条件

1.3.1.1 色谱条件

Waters AtlantisT色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流动相：A为乙腈-甲醇（1∶1，/），B为水；进样量5.0 μL；柱温40 ℃；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

1.3.1.2 质谱条件

电喷雾离子源，负离子模式；多反应监测模式；喷雾电压-4 500 V；离子源温度550 ℃；雾化气（N）压力为50 psi；气帘气（N）为35 psi；辅助加热气（N）为55 psi；质谱参数见表2。

表2 酚类化合物的质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters of phenolic compounds

1.3.2 溶液的配制

酚类化合物标准储备液的配制：准确称量各标准品10 mg（精确至0.01 mg），甲醇定容至10 mL容量瓶中，分别配成质量浓度为1 mg/mL的单标储备液，于-18 ℃冰箱保存。

混合标准中间液的配制：准确吸取各单标储备液于同一容量瓶中，配制成质量浓度为1 mg/L（BPS、BPAF和TCBPA为0.2 mg/L）的混合标准溶液，4 ℃冰箱保存。

标准工作曲线的绘制：准确吸取适量混合标准溶液，分别用乙腈和空白基质溶液配制成0.5～75.0 μg/L或0.1～15.0 μg/L系列溶剂标准工作液和基质标准工作液。以待测物质的质量浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制各标准曲线。

1.3.3 提取溶剂的选择

以动物奶油为基质，分别采用乙腈、甲醇、乙腈-水（1∶1，/）、甲醇-水（1∶1，/）、乙醇、乙腈-甲醇（1∶1，/）各5 mL，乙腈-正己烷（1∶1，10 mL）进行提取比较研究，选择适合的提取溶剂。

1.3.4 样品处理

准确称取1 g（精确至0.1 mg）奶油于50 mL具塞离心管中，再加入乙腈-甲醇（1∶1，/）5 mL涡旋振荡5 min，9 000 r/min离心15 min，取乙腈-甲醇溶液层待测。

1.3.5 方法学验证

参照1.3.4节进行样品提取，以奶油为基质，进行系列加标实验，分别以3 倍和10 倍信噪比计算检出限和定量限。

选取奶油样品，分别添加低、中、高3 个水平的14 种混标溶液，按照1.3.4节进行样品提取，同时做空白对照实验，计算相对标准偏差和加标回收率。

1.3.6 酚类化合物的迁移实验

根据GB 5009.156—2016《食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》的规定，采用全浸没的方法，按照6 dm接触面积对应1 L或1 kg食品模拟物的比例要求，开展蛋糕塑料装饰材料在真实奶油样品中的迁移实验。选择前期筛查含有BPA和NP的塑料蛋糕装饰材料作为阳性样品，以动物淡奶油和植物奶油为基质，开展迁移实验。

温度、接触时间对酚类化合物迁移的影响：由于蛋糕装饰材料一般接触裱花蛋糕奶油的表面，根据裱花蛋糕的真实贮存情况，选择4 ℃和20 ℃作为迁移温度，20、40、60、120、240 min作为迁移时间；迁移后的样品参照1.3.4节进行处理，样液经0.22 μm滤膜过滤，上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件的优化

2.1.1 流动相的优化

流动相的组成和pH值影响组分的分离效果和响应强度大小，通常采用甲酸和氨水调节流动相的酸、碱性和离子强度。考察乙腈-水、甲醇-乙腈（1∶1，/）-水、0.1%甲酸-乙腈、0.1%氨水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇-乙腈（1∶1，/）、0.1%氨水-甲醇-乙腈（1∶1，/）等作为流动相时14 种酚类化合物的出峰情况，结果发现在甲醇-乙腈-水作为流动相的条件下，14 种酚类化合物10 min内出峰完全，且响应值高、保留值好、峰形尖锐无拖尾；而甲酸的加入影响了酚类物质的响应值；氨水可提高酚类物质的离子化效率，但使得四溴双酚A和四氯双酚A两种物质的出峰时间变化。因此，选择甲醇-乙腈-水体系作为流动相。14 种酚类化合物分离的总离子流图见图1。

图1 14 种酚类化合物总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of 14 phenolic compounds

2.1.2 质谱条件的优化

由于酚类物质上的酚羟基在电离时容易失去质子，因此选择在电喷雾负离子模式下进行优化。采用针泵直接注射模式，将100 μg/L的化合物单标溶液单独进样，对母离子进行全扫描，得到分子离子峰。以分子离子为母离子进行二级质谱全扫描，获得碎片离子信息，每种酚类化合物选取2 个响应强度高且干扰较少的特征碎片作为定性、定量离子对，优化质谱参数（去簇电压、碰撞能量等），结果见表2。

2.2 提取溶剂的选择

双酚类和烷基酚类化合物的提取有针对食品接触材料、乳制品、烘焙蛋糕和水等的研究，杨金泉等研究了C、NH、HLB固相萃取柱对饮用水中BPA、BPS萃取的影响，结果表明HLB小柱对二者均有较好的富集效果。王胜利等采用乙腈对乳制品中的8 种双酚类化合物进行提取，QuEChERS-SPE净化样品，可有效去除基质的干扰。王斌等研究乙腈、40%乙腈溶液、40%乙腈-0.1%甲酸、甲醇等溶液对面粉中8 种酚类污染物的提取效果，结果表明乙腈为最适合的提取溶剂；蛋糕由于油脂含量高，则采用乙腈-正己烷提取的方法，以消除油脂的干扰。本实验选取乙腈、甲醇、乙腈-水（1∶1，/）、甲醇-水（1∶1，/）、乙醇、乙腈-甲醇（1∶1，/）、乙腈-正己烷（1∶1，/）作为提取溶剂，参照1.3.3节提取方法，对自制动物奶油阳性样品进行提取研究，14 种酚类化合物的提取回收率见图2。结果表明，乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-甲醇、乙腈-正己烷都获得了较好的提取效果，其中乙腈-甲醇提取时14 种酚类物质的整体回收率最优，为82%～116%。因此，选择乙腈-甲醇（1∶1，/）作为奶油中酚类化合物的提取溶剂。

图2 奶油提取溶剂的影响Fig. 2 Effects of extraction solvents on recoveries of phenolics

2.3 基质效应的评价

食品基质往往比较复杂，采用液相色谱-串联质谱技术分析样品时，样品中除待测成分以外的组分，常对被分析物的检测信号产生干扰，影响分析结果的准确性，从而形成基质效应。基质效应的去除常应用校正曲线法。本实验采用以空白基质液稀释系列标准溶液获得的基质标准曲线斜率与流动相标准曲线斜率的比值，评价基质效应的影响。通常斜率比值在0.8～1.2范围内时认为基质效应不明显；小于0.8时，表明存在离子抑制作用；大于1.2时，表明存在离子增强作用。表3显示，采用乙腈-甲醇提取奶油基质时，动物奶油和植物奶油基质中14 种酚类化合物的斜率比值分别为0.75～1.63和0.51～1.49，说明动物奶油和植物奶油都具有一定的基质效应。因此，可采用奶油空白基质溶液配制标准曲线来进行定量分析，以消除基质效应的干扰。

表3 不同基质中酚类化合物的基质效应Table 3 Matrix effects of 14 bisphenol compounds

2.4 线性方程、检出限与定量限结果

在空白基质样液中加入混标溶液，配成质量浓度梯度为0.5、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0 μg/L或0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μg/L（BPS、BPAF、TCBPA）系列标准混合溶液，以定量离子对峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到线性回归方程。以3 倍信噪比确定酚类化合物的检出限，以10 倍信噪比确定化合物的定量限，结果见表4。14 种酚类化合物线性相关系数（）均在0.990 4～0.999 8范围内，线性关系良好。

表4 酚类化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of phenolic compounds

2.5 回收率与精密度结果

取阴性奶油样品作为空白基质，在动物奶油和植物奶油中分别添加低、中、高3 个水平的混合标准溶液，进行加标回收实验。如表5所示，动物奶油中14 种酚类化合物的平均回收率为78.2%～117.1%，相对标准偏差为1.07%～12.1%（=3）；植物奶油中14 种酚类化合物的平均回收率为79.4%～114.6%，相对标准偏差为1.12%～12.5%（=3）。方法回收率和精密度较好，适合奶油样品的分析测定。

表5 酚类物质的回收率与精密度Table 5 Recoveries and RSD of phenolic compounds spiked in negative cream samples

续表5

2.6 酚类化合物在奶油中的迁移情况

食品中双酚类和烷基酚类化合物的污染往往来源于食品接触材料的迁移。裱花蛋糕装饰材料常用于装饰在生日蛋糕奶油的表面而与奶油接触。本实验选取前期检测为阴性的动物奶油和植物奶油为迁移基质，将前期检测BPA和4-NP为阳性的塑料蛋糕装饰品底板（可与蛋糕接触的部分），按照1.3.6节方法开展在真实奶油中的迁移实验，了解酚类化合物在液态奶油中的迁移和溶出情况。

通常情况下，接触温度和接触时间会对化合物的迁移有影响。温度越高，分子扩散运动越活跃，也就越易迁移；时间越长，化合物迁移量也会增多。罗玉玮、王君等分别研究了BPS、壬基酚在不同浓度食品模拟液水、乙醇、乙酸等中的迁移规律，均得出了迁移温度越高、时间越长、迁移量越大的结论。如图3所示，在不同温度和时间下，BPA和4-NP在动物奶油和植物奶油中均发生了迁移，20 ℃时的迁移量均高于4 ℃时的迁移量；随着时间的延长，迁移量也逐渐增多。实验发现，BPA和4-NP在前60 min内迁移量增幅较快，120 min后开始增长变缓，综合考虑裱花蛋糕的实际贮藏和使用情况，选择120 min作为后期样品测定的迁移时间。

图3 不同温度和时间下塑料接触材料中BPA（A）和4-NP（B）向奶油中的迁移Fig. 3 Migration of BPA (A) and 4-NP (B) into cream from plastic contact materials

2.7 样品测定结果

选取液体动物淡奶油为迁移基质，采用最优条件对市场和网店随机购买的21 个塑料蛋糕装饰摆件、插杆和底托等进行迁移量测定，迁移温度选择20 ℃，迁移时间选择120 min，结果见表6、图4。有8 个样品检出了酚类化合物，主要集中在BPA、BPS和4-NP，BPA、BPS检出样品分别为3 个和1 个，迁移量最高值分别为4.61、0.94 μg/kg；4-NP检出的样品数最多为7 个，迁移量最高值为125.1 μg/kg。国家标准规定食品接触用塑料树脂、涂料和涂层中特定迁移限量要求是BPA 0.6 mg/kg、BPS 0.05 mg/kg，样品中BPA和BPS在奶油中迁移2 h的迁移量均低于迁移限量；目前尚无壬基酚的限量要求。BPA、BPS和4-NP是酚醛树脂、可塑性聚酯等高分子材料生产过程中重要的原料，它们的暴露会干扰人体内分泌系统，造成内分泌失调、新陈代谢紊乱等，影响人体健康。因此，应持续关注酚类化合物迁移可能带来的食品安全风险。图4为典型阳性样品中Y2检出BPA和4-NP、Y4中检出BPS的色谱图。

表6 塑料蛋糕装饰材料中酚类化合物的迁移量Table 6 Migration of phenolic compounds from plastic cake decorations

图4 典型阳性样品中BPA、4-NP和BPS的多反应监测图Fig. 4 Multi-reaction monitoring chromatograms of BPA, 4-NP and BPS in typical positive samples

3 结 论

建立了乙腈-甲醇为提取溶剂、高效液相色谱-三重四极杆串联质谱同时测定奶油中14 种酚类化合物的检测方法，用于塑料中BPA和4-NP阳性样品在奶油中的迁移规律，以及塑料蛋糕装饰材料在奶油基质中迁移量的测定分析。结果表明，14 种酚类化合物的检出限为0.15～0.75 μg/kg，定量限为0.5～2.5 μg/kg，线性关系良好，相关系数均大于0.99，酚类化合物在动物奶油中的回收率为78.2%～117.1%，相对标准偏差为1.07%～12.1%（=3）；在植物奶油中的回收率为79.4%～114.6%，相对标准偏差为1.12%～12.5%（=3）。塑料接触材料阳性样品中的BPA和4-NP在奶油发生了迁移，随着迁移温度的升高和时间的延长，迁移量逐渐增大。选择120 min作为迁移时间，对市售的塑料蛋糕装饰摆件等在动物淡奶油中的迁移量进行测定，迁移的化合物主要集中在BPA、BPS和4-NP，BPA和BPS迁移量最高值分别为4.61、0.94 μg/kg；4-NP迁移量最高值为125.1 μg/kg，检出的样品数量最多。双酚类和烷基酚类化合物其迁移到食品中的安全性不容忽视。本方法的建立和迁移研究，可为食品和食品相关产品的安全监管提供技术支持。