葡萄酵素发酵过程中代谢产物的动态变化

王印壮，段定定，丁玉峰，马艳莉,,*，牟建楼,*，席晓丽，谷晓东，宋乾华

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南 南阳 473000）

食用植物酵素起源于日本，已有上百年历史，20世纪初进入我国市场。已有研究表明，食用植物酵素富含多种生理活性物质，具有抗氧化、调节免疫以及解酒护肝等功效。随着人们健康意识的提高，大众对食用植物酵素产品的关注度越来越高。根据我国工业和信息化部制定的QB/T 5323—2018《植物酵素》标准，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类使用的酵素产品。在其制备工艺中起关键作用的是各种微生物，通过微生物的发酵作用将原料中的物质进行转化，形成代谢产物释放于酵素之中，使其具有丰富的风味物质，并且在发酵过程中产生的各种生理活性物质以及发酵微生物大多为益生菌，从而又使其具有功能性。目前，市场上的酵素产品多以自然发酵生产，发酵过程不易控制，易染杂菌且发酵时间较长，不易满足日益扩大的市场需求和实现大规模工业化生产，因此，条件可控且稳定的接种发酵技术得到发展。莫大美等以玫瑰花为原料，接种酵母、乳酸菌和巴氏醋杆菌发酵制备酵素，研制出一种具有玫瑰花色泽和香气、口感极佳、超氧化物歧化酶活性高的玫瑰花酵素产品。洪厚胜等以葡萄果渣、糖蜜等为原料，采用响应面法，优化接种酵母菌、醋酸菌以及乳酸菌发酵酵素工艺，生产出富含多种有机酸、香气成分以及色泽亮丽、口感、滋味均佳的酵素产品。在利用接种发酵技术制备酵素时，研究发酵过程中代谢产物的动态变化规律，对酵素产品的品质提升及发酵终点的判定具有重要意义。陈英等以蔬菜、水果、菌类等为原料，接种酵母菌、乳酸菌和醋酸菌发酵制备酵素，对发酵过程中微生物的数量、理化指标及挥发性成分进行了监测和分析，得出发酵过程中的物质变化规律，为其实现大规模工业化深层发酵生产以及优化产品品质提供了技术参考和理论依据。

葡萄富含多种营养物质，是世界上栽培面积最大、产量第二的水果，但其季节性较强、贮存期较短，采后需及时进行深加工。因此，本研究以葡萄为原料，采用依次接种酵母菌、醋酸菌及乳酸菌的接种发酵技术，分析发酵过程中总酸、有机酸、乙醇体积分数、总酚、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及-葡萄糖苷酶活力、挥发性风味成分等的动态变化规律，以期为实现葡萄酵素的工业化生产、综合性开发以及品质的提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与试剂

夏黑葡萄（Summer Black）来自河南省南阳市社旗县；酿酒酵母XQ-05来自河南省工业微生物菌种保藏中心；巴氏醋杆菌CGMCC 1.41、植物乳杆菌ACCC 11095来自北京生物保藏中心。

果胶酶（酶活力500 U/mg） 诺维信有限公司；MRS肉汤（乳酸菌通用培养基，生物试剂） 北京奥博星生物技术公司；0.45 μm聚偏氟乙烯中空纤维微滤膜天津爱生膜公司；柠檬酸、乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸（色谱级） 美国Sigma公司；没食子酸（分析纯）天津科密欧公司；磷酸（色谱级） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、邻苯三酚、对硝基苯酚（色谱级） 上海科密欧公司；福林-酚（分析纯） 上海麦克林试剂公司。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸出粉10 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min（固体培养基再加入1.5%琼脂粉）。

许氏醋酸菌种子培养基：葡萄糖5 g，酵母浸出粉5 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，冷却后加入30 mL无水乙醇。

1.2 仪器与设备

GC-7890气相色谱仪、7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、1260高效液相色谱仪 美国Agilent仪器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司；AL-04电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-752N紫外-可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅金坛市晶玻实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酵素制备

挑选新鲜无损坏的葡萄，洗净、晾干、打浆后放入已灭菌的玻璃罐中，添加红糖至糖度为18 °Brix，利用75 mg/mL酶活力500 U/mg的果胶酶于50 ℃酶解40 min，之后100 ℃灭菌15 min，冷却至室温，得到发酵基质，测定其还原糖质量浓度（31.91±5.14）g/L，pH 3.77±0.01。

将保藏于甘油管中的3 株菌，分别取20 μL于不同固体培养基中，待长出单菌落后接种于相应的液体培养基（酵母菌为YEPD培养基、醋酸菌为许氏醋酸菌种子培养基、乳酸菌为MRS肉汤）中活化，得不同菌株活化液，浓度大于10CFU/mL。以3%（/）接种量将不同菌株活化液接种于相应的液体培养基中摇床培养制备发酵菌液，酵母菌于28 ℃、150 r/min摇床培养14 h，巴氏醋杆菌于30 ℃、180 r/min摇床培养48 h，植物乳杆菌于37 ℃、200 r/min摇床培养22 h。

首先，接入发酵基质体积3%酵母菌液，常温避光发酵6 d；再接入发酵基质体积5%醋酸菌液，至第27天；采用4 层无菌纱布过滤去渣，而后利用0.45 μm的中空纤维微滤膜过滤除菌；最后接种发酵基质体积的3%乳酸菌液，发酵至第41天。分别于第0、3、6、13、20、27、34、41天平行取样3 次。为避免杂菌污染，以上所有操作均在无菌室中进行。

1.3.2 总酸含量的测定

参照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》中的方法。

1.3.3 有机酸含量的测定

将2.5 mL样品与1 mL 10.6%的KFe(CN)·3HO、1 mL 30.0%的ZnSO溶液混合，用去离子水定容至50 mL，反应30 min后取上清液离心，再经0.45 μm膜和C柱过滤。检测条件：色谱柱Eclipse XDB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量10 μL，流速0.9 mL/min，流动相0.02 mol/L磷酸二氢钠（磷酸调pH 2.1），柱温30 ℃，检测器二极管阵列检测器，检测波长210 nm。

1.3.4 乙醇体积分数的测定

参照陈玉香等的气相色谱法。

1.3.5 总酚含量的测定

采用福林-酚方法测定。其标准曲线回归方程及相关系数为＝0.001 1-0.001 9，＝0.998 9。

1.3.6 SOD及-葡萄糖苷酶活力的测定

-葡萄糖苷酶活力测定参照侯晓瑞的方法；SOD活力测定参照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》中的邻苯三酚自氧化法。

1.3.7 挥发性风味成分测定

将7.5 mL样品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇添加到20 mL顶空瓶中，置于40 ℃水浴锅中平衡15 min，将固相微萃取纤维头插入顶空瓶中萃取吸附40 min后，放入气相色谱进样器中解吸6 min。检测条件：色谱柱为HP-INNOWax毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；烘箱升温程序为50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升温至80 ℃，再以5 ℃/min升温至230 ℃，保持6 min；注射器温度240 ℃；载气（氦气）流量1.45 mL/min，分流比5∶1；离子源和质谱传输线温度分别为240 ℃和250 ℃，电子能量为70 eV，质量范围为/33～550。

利用气相色谱-质谱中美国国家标准与技术研究所发布的NIST14.L质谱数据库结合保留时间，对匹配度≥80的香气物质进行定性分析；以已知浓度的3-辛醇为内标物，采用内标法，通过样品中各挥发性风味成分与内标物3-辛醇峰面积比值进行定量。

1.4 数据处理

数据均采用 ±表示，利用软件IBM SPSS Statistics 26对数据进行单因素方差分析（＜0.05）以及最小显著差数法、Duncan多重比较分析，利用软件Origin 2019绘制图形。

2 结果与分析

2.1 葡萄酵素发酵过程中总酸及柠檬酸、乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸的变化

酵素发酵中伴随着各种生物化学反应以及微生物活动等过程，酸类物质是该过程中重要的代谢产物，其中总酸度可反映出食用植物酵素的成熟度以及质量品质，而有机酸则可赋予酵素独特的风味，其不仅是发酵代谢产物，还可作为发酵环境中微生物的碳源和电子供体，其种类和数量在发酵过程会发生变化。由表1、图1可知，接种酵母菌发酵期间（0～6 d），总酸含量显著升高（＜0.05），柠檬酸、苹果酸、酒石酸含量增多，而乙酸则未检出。研究发现葡萄中有机酸主要以柠檬酸、苹果酸和酒石酸为主，乙酸含量少，几乎检测不出。因此表明该阶段主要为酵母菌的发酵作用将葡萄基质中的有机酸进一步溶出并且通过糖代谢积累代谢产物。接种醋酸菌后（6～27 d），由于醋酸菌适应基质较为缓慢，发酵前7 d总酸含量变化不显著（＞0.05），而后发酵13～27 d含量急剧升高，这是因为醋酸菌适应基质后将酵母菌发酵产生的大量乙醇转化为乙酸，大幅提高了总酸含量（图1）。但该阶段乳酸含量逐渐降低，Elferink等研究发现乳酸含量降低与乙酸的积累相关，因此，这可能与葡萄酵素发酵过程中乙酸积累有关。接种乳酸菌后（27～41 d），总酸含量继续升高并于34 d达到最大值，而后略微降低。陈小伟等在探究草莓酵素发酵过程中总酸含量的变化时，发现发酵前75 d总酸含量不断增加至78.98 mg/mL，而后略微降低，这主要是由于总酸的累积，影响了发酵菌株的繁殖与代谢，而且后期主要是接种乳酸菌发酵，故多元酸的持续降解会导致酸度略微下降，并且发酵后期，基质中糖类含量减少，有机酸也可能作为微生物的替代碳源而被消耗。乳酸、柠檬酸质量浓度在乳酸菌发酵期间（27～41 d）逐渐增加至最大值102.09 mg/L和67.70 mg/L，而苹果酸减少至0，这可能是因为乳酸菌通过三羧酸循环、苹果酸发酵等途径，将苹果酸转化为柠檬酸、乳酸等所致。在葡萄酵素接种发酵的3 个阶段中，醋酸菌发酵阶段（6～27 d）对总酸和有机酸含量的增加贡献最大，并且该阶段主要产生醋酸，其发酵结束时醋酸质量浓度达到（3 127.80±2.36）mg/L。研究表明，发酵中产生适量的醋酸可提高酵素产品的营养及风味，还可抑制腐败微生物生长，但当酸度过高时，则会对酵素产品的风味造成负面影响。何翠婵在研究微生物对青梅汁酸度的降低作用时发现，利用植物乳杆菌能够实现有效降酸，并且发酵后期由于基质糖浓度的降低，有机酸也可被微生物作为替代碳源利用，这与本研究在接种乳酸菌发酵后期，总酸以及有机酸含量有所降低一致。因此，在接种乳酸菌发酵（27～41 d）期间，其不仅可以起到提高产品营养成分和功能的作用，还可改善酵素风味，使得产品更加柔和协调。

表1 葡萄酵素发酵过程中总酸含量的变化Table 1 Changes of total acid content during fermentation of grape Jiaosu

图1 葡萄酵素发酵过程中柠檬酸、乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸含量的变化Fig. 1 Changes of citric acid, lactic acid, acetic acid, malic acid,tartaric acid contents during fermentation of grape Jiaosu

2.2 葡萄酵素发酵过程中乙醇含量的变化

酵母菌在发酵葡萄酵素过程中，会发生糖代谢生成乙醇等代谢产物，其含量会影响产品风味和质量，是食用植物酵素的基本理化指标。由表2可知，在接种酵母菌（0～6 d）发酵过程中，乙醇含量显著增加（＜0.05）；而后接种醋酸菌（6～27 d）发酵时并未除去酵母菌，这主要是因为研究发现，醋酸菌启动发酵以及适应基质环境较为缓慢，而酵母菌与醋酸菌具有互利共生的关系，当与酵母菌共生发酵时有促进其生长的作用。同时，这也是导致接种醋酸菌发酵（6～27 d）后乙醇含量呈先缓慢降低后急剧下降的原因，发酵结束时乙醇体积分数降低至（0.49±0.09）%。接种乳酸菌（27～41 d）发酵后，乙醇体积分数继续降低，随后逐渐稳定于0.47%，无显著差异（＞0.05）。张巧等探究大果山楂酵素在发酵过程中乙醇含量的变化时发现，在发酵前期，由于酵母菌的发酵作用，产生了大量乙醇，乙醇体积分数持续增加，达到最大值后，在醋酸菌以及发酵后期发生的酯化反应的作用下，使得乙醇含量逐渐降低并趋于稳定，这与本研究结果基本一致。

表2 葡萄酵素发酵过程中乙醇体积分数的变化Table 2 Changes of ethanol content during fermentation of grape Jiaosu

2.3 葡萄酵素发酵过程中总酚含量的变化

葡萄中含有丰富的酚类物质，广泛分布在葡萄的皮、茎、叶子和核中，其具有抗氧化、抗癌及调节心血管等作用。由图2可知，葡萄酵素发酵过程中，总酚含量总体呈波动上升趋势，发酵结束时总酚质量浓度达到最大值466.00 mg/L，显著高于其他发酵时间样品（＜0.05），相较于葡萄浆汁，总酚含量提高到2.16 倍，因此发酵过程可显著提高葡萄酵素的总酚含量。除此之外，已有报道表明其他酵素产品也有此类现象，例如潘梓源等在优化的桂圆酵素发酵工艺下（菌株组合酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌1∶1∶1、接种量10%、发酵温度30 ℃、时间36 h），制备的桂圆酵素总酚含量是桂圆水提液的5.05 倍。范昊安等在探究苹果梨酵素发酵过程中总酚含量的变化时，发现发酵结束后总酚含量约增长17.52 倍。刚开始未接种的葡萄浆汁中总酚含量较高，是由于在制备发酵基质时未去除果皮与核。发酵过程中总酚含量的升高，主要有以下两个方面的原因，其一是发酵基质中高糖以及发酵过程中产生的有机酸等物质产生的高渗透环境使得葡萄基质中的酚类物质溶出；其二是发酵体系中的微生物可使结合酚类、大分子酚类物质转化成游离、小分子酚类物质，使其含量增加。接种醋酸菌发酵前期（6～13 d）以及接种乳酸菌发酵前期（27～34 d）总酚含量有所下降，这主要是由于在发酵过程中酚类达到一定浓度时对微生物具有抑制作用，因此发酵微生物在生长代谢过程中会产生分解酚类的物质。以上表明，葡萄酵素发酵过程中酚类物质的变化与原料、发酵条件以及微生物的作用等有关。

图2 葡萄酵素发酵过程中总酚含量的变化Fig. 2 Changes of total phenol content during fermentation of grape Jiaosu

2.4 葡萄酵素发酵过程中SOD以及β-葡萄糖苷酶活力的变化

食用植物酵素在发酵过程中会代谢生成多种功效酶类，例如蛋白酶、-葡萄糖苷酶以及SOD等，其中SOD常被用来衡量食用植物酵素酶活性的高低，而-葡萄糖苷酶则与食用酵素香气成分的形成以及酚类物质的释放有关。因此，分析葡萄酵素发酵过程中SOD及-葡萄糖苷酶活力的动态变化具有重要意义。由图3所示，葡萄酵素发酵过程中SOD活力整体呈波动升高的趋势，这主要是因为发酵过程中基质环境的改变以及微生物生长代谢分泌相应的功效酶所导致。接种酵母菌（0～6 d）发酵以及接种醋酸菌发酵前中期（6～20 d），SOD活力在22.89～45.00 U/L之间变化且变化不显著（＞0.05）。随后接种乳酸菌后，SOD活力继续升高至最大值135.00 U/L，符合QB/T 5323—2018中SOD活力≥15 U/L的要求，这表明接种发酵有利于葡萄酵素SOD的产生。-葡萄糖苷酶活力变化与总酚含量变化趋势一致，在接种酵母菌（0～6 d）发酵、接种醋酸菌发酵中后期（13～27 d）以及接种乳酸菌发酵后期（34～41 d）其活力逐渐升高，而接种醋酸菌发酵前期（6～13 d）以及接种乳酸菌发酵前期（27～34 d）其活力下降，发酵结束时酶活力达到最大值266.57 μU/mL，且显著高于其他发酵时间样品（＜0.05），这与阎欲晓等研究发现黑曲霉固态发酵甘蔗叶过程中，酚类物质的释放与-葡萄糖苷酶活力呈显著正相关一致。这表明葡萄酵素发酵过程中酚类含量的变化与微生物发酵过程中代谢生成的-葡萄糖苷酶活力等有关。

图3 葡萄酵素发酵过程中SOD及β-葡萄糖苷酶活力的变化Fig. 3 Changes of SOD and β-glucosidase activity during fermentation of grape Jiaosu

2.5 葡萄酵素发酵过程中挥发性风味成分的变化

食用酵素在发酵过程中，不仅能最大程度保留原料本身的香气成分，而且还可赋予酵素产品新的风味，其挥发性风味成分与原料、发酵方式以及菌种等因素相关。因此，探究葡萄酵素发酵期间挥发性风味物质的变化，对产品精准制备及品质优化具有重要意义。由表3、图4可知，葡萄酵素发酵过程中产生的挥发性风味成分主要以醇类、酸类和酯类化合物为主，从葡萄浆汁中共检测出19 种挥发性风味成分，其中酯类6 种、醇类5 种、醛类4 种、醚类2 种、酸类1 种、其他类1 种。发酵结束后葡萄酵素中共检测出21 种香气成分，其中有9 种香气成分与葡萄浆汁相同，新产生的12 种香气成分主要为乙酸异戊酯、乙酸甲酯等酯类，乙酸、丙酸等酸类以及苯乙醇等醇类物质。

醇类物质主要由发酵过程中微生物代谢氨基酸、糖类等物质产生。由表3、图4可知，醇类物质主要在接种酵母菌（0～6 d）发酵期间产生，其含量和种类均显著增加（＜0.05），随后接种醋酸菌和乳酸菌后，其含量显著降低（＜0.05），但其种类并未发生明显变化。醇类物质一方面可赋予葡萄酵素愉悦的风味，如少量高级醇使得葡萄酵素具有淡雅的风味，另一方面还可以与酸类物质发生酯化反应，生成葡萄酵素典型的特征性香气成分酯类物质。酯类物质具有果香味，其阈值低且气味活度值较高，故对葡萄酵素的风味贡献较大，在葡萄酵素发酵后期，长链脂肪酸乙酯的生成可以减少葡萄酵素的涩口感，提高其醇厚感。醛类物质在发酵过程中其含量呈先升高后降低的趋势，且其种类逐渐减少，发酵结束时醛类物质含量减少至0，这与任婷婷等在探究苹果浆发酵过程中醛类物质的变化相似。醛类物质不稳定，在发酵过程中可被氧化还原为酸或醇类物质。葡萄酵素发酵过程中特征挥发性风味成分主要以醇类、酸类及酯类物质为主，其他香气成分贡献较小，因此，在发酵生产葡萄酵素过程中要合理调控工艺参数，使得各类香气成分达到最佳水平，并且后续还需进一步探究并结合各类非挥发性成分在发酵中的变化规律，从而生产出优质的葡萄酵素产品。

表3 葡萄酵素发酵过程中各类香气成分质量浓度的变化Table 3 Changes in concentration of each class of aroma components during fermentation of grape Jiaosu μg/mL

图4 葡萄酵素发酵过程中各类香气成分的变化Fig. 4 Changes of number of aroma components during fermentation of grape Jiaosu

3 结 论

接种发酵葡萄酵素过程中，不同菌株发酵阶段所代谢生成的有机酸不同，在接种酵母菌（0～6 d）发酵过程中主要代谢产生柠檬酸、苹果酸、酒石酸，接种醋酸菌后（6～27 d）主要生成乙酸，而后乳酸菌发酵阶段（27～41 d），主要代谢生成乳酸、柠檬酸；总酸在发酵过程中呈先升高后略微下降的趋势，乙醇主要于酵母菌（0～6 d）发酵期间产生，随后逐渐降低并趋于稳定。总酚含量在发酵过程中的变化趋势与-葡萄糖苷酶活力一致，研究发现其与酚类物质的变化具有正相关性。葡萄酵素发酵过程中SOD活力总体呈波动上升趋势，发酵结束时达到最大值135.00 U/L，所生成的挥发性风味成分主要以醇类、酸类和酯类物质为主。通过以上研究明确了葡萄酵素接种发酵过程中代谢产物的变化规律，可为葡萄酵素的工业化生产、综合性开发以及品质的优化提供理论依据和技术参考。