超高效液相色谱串联质谱法在同时测定肺脾气虚汤中15 种主成分中的应用

王贞丽，王志鹏，崔莉莉，宋新华，许封菁，高守红

新型冠状病毒肺炎是一种急性呼吸道传染病。具有传播速度快，传播能力强，持续时间久，且可通过轻症甚至无症状者传播。中医药作为世界传统医学的重要组成部分，在新型冠状病毒肺炎疫情期间，其早期介入、分类救治和后期康复的方法，都有举足轻重的作用［1］。对于恢复期患者以扶正为主、兼以驱邪的治疗原则，恢复人体“正气”，提高机体抗病能力。火神山医院新冠肺炎恢复期肺脾气虚汤由法半夏、陈皮、党参、炙黄芪、茯苓、藿香、砂仁等7 味药材组成，用于治疗以气短，倦怠乏力，纳差呕恶，痞满，大便无力，便溏不爽，舌淡胖，苔白腻为主要表现的恢复期证候［2］。研究表明法半夏多糖可作为治疗哮喘炎症和粘液过度分泌的药物［3］；炙黄芪具有非特异性免疫和巨噬细胞吞噬能力，且有较好的补气作用［4］；陈皮广泛应用于临床治疗恶心、呕吐、消化不良、乏力、腹泻、咳嗽、咳痰等［5］；党参可以改善不良的胃肠功能，治疗胃溃疡和慢性胃炎［6］。

本研究应用超高效液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS），对肺脾气虚汤中15 种主成分（原儿茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、异槲皮苷、去氢土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白术内脂Ⅲ、毛蕊异黄酮、桔皮素、川陈皮素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷）进行含量测定，为其质量控制及临床用药安全提供保障［7-8］。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1200 系列高效液相色谱仪（Agilent Technologies，美 国），包 括G1311A 型 四 元 泵、G1322A 型真空脱气机、G1329A 型自动进样器和G1316A 型柱温箱。安捷伦6410A 三重四级杆串联质谱仪由美国安捷伦科技公司制造（Agilent Technologies，美国），离子源为ESI 型，数据采集及处理系统采用MassHunter 化学工作站。定时可调速旋涡混合器（美国labnet 公司），Eppendorf 5418R 型台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf 公司），百万分之一电子天平，MES3.6P-0CE0DM 型（赛多利斯，哥廷根，德国，最大称重3.1 g，分辨率0.001 mg）；单通道移液枪，Reaserch plus 型，量程10、20、100、200、1 000 μl（德国Eppendorf 公司）。超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK7200H 型）。涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，Vortex QL-901 型），煎药壶（苏泊尔液体加热器，SW-30Y06），灌装针头式滤器（上海泰坦科技股份有限公司，聚醚砜PES，0.22 μm，13 mm）。

1.2 试剂及药品

对照品：原儿茶醛（批号：MB7049）、芒柄花素（批号：MB1977）、芹菜素（批号：MB6830）、异槲皮苷（批号：MB7071）购自美伦生物有限公司，甘草苷（批号：Z13J11X108109）、去氢土莫酸（批号：Z25J10S939 09）、茯苓新酸A（批号：P07J8L28173）、刺槐素（批号：C12O8Q45551）、橙皮苷（批号：P06D9F77001）、毛蕊异黄酮苷（批号：Y13F11H108672）、毛蕊异黄酮（批号：Y24N9Y75652）、刺芒柄花苷（批号：P03A10F84910）、白术内酯Ⅲ（批号：M13D10S10567 6）、桔皮素（批号：H24F11K108893），川陈皮素（批号：N10J10R90249）、内标利血平（批号：Y02M11Y17235）购自上海源叶有限公司；中药饮片：法半夏、陈皮、党参、炙黄芪、茯苓、藿香、砂仁由购自上海长征医院药剂科，经鉴定为正品；试剂：甲醇（质谱纯，Merck 公司，德国），乙腈（质谱纯，Merck 公司，德国），甲酸（色谱纯，天地公司，美国），蒸馏水（屈臣氏，中国）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB - C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相A 为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B 为0.1%甲酸-5 mmol/L醋酸铵水溶液，梯度洗脱，流速0.4 ml/min，进样量5 μl，柱温35 ℃，正离子运行时间7.5 min，负离子运行时间8.5 min，梯度洗脱条件见表1。

表1 正负离子化合物不同梯度洗脱条件

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，监测模式选择正负离子模式分析，质谱喷雾针电压（Capillary）设置为4 000 V，离子源温度设置为350 ℃。雾化气及干燥气选用氮气（N2），碰撞池所用气体为高纯N2，设置压力为0.1 MPa（1.0 ATA）；其他质谱参数优化结果如下：雾化气压力设置为0.276 MPa；MS1 和MS2 的加热温度均为105 ℃；气体流速设置为10 ml/min，扫描方式为多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）。所测定的对照品溶液和内标溶液，ESI 电离方式下，进行产物离子全扫描分析，质谱参数见表2。

表2 肺脾气虚汤中15 种主成分质谱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称定原儿茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、异槲皮苷、去氢土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白术内脂Ⅲ、毛蕊异黄酮、桔皮素、川陈皮素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、华法林和利血平对照品约2.00 mg，分别置于2 ml 容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，分别得到浓度约为1.00 mg/ml 的对照品贮备液。再分别精密量取对照品贮备液适量，以甲醇依次稀释成浓度为100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml 的对照品溶液。于-20 ℃冰箱保存，备用。

2.2.2 供试品溶液 取肺脾气虚汤方药1 份，加水800 ml，浸泡30 min 后，煎煮100 min，冷却，过滤，量取煎煮液10 ml，水浴蒸干，加70% 乙醇溶液1 ml 溶解后，14 000 r/min，离心20 min，取上清液，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液以及空白溶液，按照“2.1”项下色谱质谱条件分别进样，记录色谱图，结果表明，供试品色谱中与对照品色谱上相同保留时间有对应的色谱峰，峰形良好。空白溶液色谱中，在相同的保留时间无色谱峰，说明本方法专属性好，结果见图1。

图1 肺脾气虚汤中15 种主成分及内标的色谱图

2.3.2 线性关系考察 精密吸取2.2.1 中对照品溶液适量，甲醇稀释成对照品浓度为白术内脂Ⅲ和桔皮素为50、100、125、250、500、1 000、1 250 ng/ml，毛蕊异黄酮和芒柄花苷为100、200、250、500、1 000、2 000、2 500 ng/ml，川陈皮素和毛蕊异黄酮苷为200、400、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml，原儿茶醛、芹菜素和异槲皮苷为50、80、100、200、400、800、1 000 ng/ml，甘草苷为5、8、10、20、40、80、100 ng/ml，橙皮苷为10 000、16 000、20 000、40 000、80 000、160 000、200 000 ng/ml，芒柄花素为150、240、300、600、1 200、2 400、3 000 ng/ml，刺槐素为500、800、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000 ng/ml，去氢土莫酸为15、24、30、60、120、240、300 ng/ml，茯苓新酸A 为1、1.6、2、4、8、16、20 ng/ml，内标浓度为5 μg/ml 的7-1 号系列梯度，按照“2.1”项下色谱质谱条件进样测定；上述测定。以峰面积为纵坐标（Y），分析物浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得出各组分的线性回归方程和范围，结果显示15 种成分的r值均大于在0.99，线性关系良好，结果见表3。

表3 肺脾气虚汤各成分的线性考察结果

2.3.3 重复性试验 取同一批样品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下的色谱和质谱条件进样，测定峰面积，并计算15 种主成分峰面积的相对标准偏差（RSD），RSD 结果在1.0%～7.7%之间，均小于15%，表明该方法重复性良好，结果见表4。

2.3.4 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱和质谱条件分别连续进样6 次，测定峰面积，并计算15 种成分峰面积的RSD值，RSD 结果在0.8%～5.9%之间，均小于15%，表明仪器精密度良好，结果见表4。

表4 肺脾气虚汤15 种主成分的重复性、精密度、稳定性RSD 考察（%）

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下的色谱和质谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，并计算15 种成分峰面积的RSD值，去氢土莫酸和茯苓新酸A 在4 h 内的RSD 小于15%，其它13 种化合物24 h 内的RSD 均小于15%，表明供试品溶液中去氢土莫酸和茯苓新酸A两种成分在4 h 内稳定，其它13 中成分在24 h 内稳定，结果见表4。

2.3.6 加样回收率试验 称取已测定的肺脾气虚汤样品6 份，精密加入与样品中各成分含量相当的混合对照品溶液至50 ml 容量瓶中，按“2.2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱和质谱条件进行分析，记录待测成分的峰面积，并计算回收率及RSD 值。平均加样回收率为95.53%～108.96%，RSD 在0.4%～9.6% 之间，表明提取方法的准确度良好，结果见表5。

表5 肺脾气虚汤各组分加样回收试验结果

2.3.7 样品测定 取5 批肺脾气虚汤样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱和质谱条件进样测定，计算各成分含量，结果见表6。

表6 5 批肺脾气虚汤样品中15 种化合物的含量(μg/g)

3 讨论

采用UHPLC-MS/MS 法对肺脾气虚汤中原儿茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、异槲皮苷、去氢土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白术内脂Ⅲ、毛蕊异黄酮、桔皮素、川陈皮素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷等15 种主成分进行了方法建立与优化，保证了肺脾气虚汤的质量控制。由于该方中各成分之间存在含量高低不均等问题，故为实现15 种成分完全分离和快速检测，分别对色谱柱、流动相组合以及流动相梯度进行优化，最终以Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相A 为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B 为0.1%甲酸-5 mmol/L醋酸铵溶液，梯度洗脱进行分析。由于安捷伦6410A 三重四级杆串联质谱仪不能在同一时间段正负离子同时切换，所以建立了正离子和负离子两套梯度洗脱程序，并进行了两套方法学验证。在此条件下，15 种成分色谱分离效果较好，专属性强，分析时间短。

在含量测定的指标成分选择上，法半夏药材的炮制中，带入了甘草，故选择甘草苷进行测定；芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷4 种来源于炙黄芪药材的成分，为方中的补中益气成分；由含量测定结果可知，来源于陈皮中的橙皮苷、桔皮素、川陈皮素在该处方中的含量较高，研究证实这些成分均有一定的保肝、祛痰止咳等药理作用；其它成分分别具有补气健脾，祛湿化痰等作用；故本研究将此15 种成分作为最终的含量测定指标。

综上所述，本研究建立的UHPLC-MS/MS 法同时测定肺脾气虚汤中原儿茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、异槲皮苷、去氢土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白术内脂Ⅲ、毛蕊异黄酮、桔皮素、川陈皮素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷等15 种主成分的定量方法简单、快捷、准确，为评价肺脾气虚汤的质量，保证其用药的安全提供参考。