差异表达的非编码RNA在脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征中的作用

闵思敏 张小楠 丁渡山 刘赛赛 李言

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种ICU中常见的病死率较高的临床综合征，ARDS发生时，富含蛋白质的液体在肺泡中积聚，阻止肺部充满足够的空气，从而导致到达血液中的氧气减少，发生低氧血症[1-2]。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)由严重的感染、外伤、休克、吸入有害气体及中毒等直接或间接因素引起的全身炎症反应综合征在肺部的表现，以肺泡及肺实质发生急性炎症为主要病理特征，其特点是发生低氧血症、非心源性肺水肿、肺顺应性降低和广泛的毛细血管渗漏[3]。在2012年柏林会议急性呼吸窘迫综合征分类中，“急性肺损伤”一词被弃用，建议使用轻度急性呼吸窘迫综合征(ARDS)代替急性肺损伤(ALI)[4]。脓毒症是一种综合征，其特征是宿主对入侵病原体的反应失调，肺是最早受累也是最常见的衰竭器官[5]。目前，人们通过LPS建立在体或离体脓毒症肺损伤模型来研究ARDS。在临床上，ARDS仍然缺乏有效和特异的治疗药物，发病率及病死率仍然高于其他疾病，甚至高达35%～45%[6]。尽管多年来，研究者们对ARDS发病机制进行了各个层面的深入研究，但脓毒症诱发ARDS发病机制涉及到多个信号通路的调节，多个基因靶点调节机制，所以深入研究ARDS的发病机制，寻找基因治疗的新靶点，可为临床开发ARDS的靶向药物提供新的见解。

非编码RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是一类功能RNA转录本，不能被翻译成蛋白质。高达80%的人类基因组编码大量的ncRNA，然而它们通过多种机制调控基因表达。核糖体RNA(rRNA)和转移RNA(tRNA)是细胞中最丰富的两种ncRNA类型[7]，其他的ncRNAs根据其大小，是否大于200个碱基分为短ncRNAs(sncRNAs)和长ncRNAs(lncRNAs)，sncRNA包括microRNA(miRNA)，小干扰RNA(siRNA)等。与线性lncRNAs不同，环状RNA(circRNAs)是单链环状ncRNAs，通常由前体mRNA(pre-mRNA)剪接生成[8]。在功能上，miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA是调节转录本，在转录后水平上，蛋白质的表达可以由miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA来调控。近年来人们对miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA的研究日益深入，本文就近年来非编码RNA在脓毒症诱导的ARDS发病机制中的研究进行综述。

miRNAs与脓毒症诱导的ARDS

miRNAs是一种由内源基因编码的非编码单链RNA小分子，这些反式作用的小RNA主要与特定mRNA的3′非翻译区中的顺式元件结合，通过调节mRNA的转录或稳定性，从而发挥调控作用[9]。由于其转录后的调控能力，miRNAs参与细胞凋亡和增殖、免疫应答和代谢等生物过程。脓毒症诱导的ARDS表现为促炎基因网络的过度激活或者是不受调控的表达，这种现象被称为“细胞因子风暴”，而细胞因子风暴受到miRNAs的极大影响。所以miRNAs在基因的水平上参与脓毒症诱导的ARDS，并成为干预治疗的一个新靶点。

一、miRNAs通过TLR4/NF-κB信号通路调控脓毒症诱导的ARDS

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是启动炎症反应的重要模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，免疫反应中TLRs识别病原微生物的致炎组分。核转录因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)家族有五种蛋白，其中最常见的NF-κB二聚体是由RelA(p65)与p50组成的。TLR4识别LPS所致的炎症反应，TLR4与LPS结合后可以激活多条途径对NF-κB进行调控。在髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖性TLR信号转导通路调控NF-κB途径中，当MyD88与白细胞介素-1受体相关激酶(Interleukin-1 receptor associated kinases，IRAKs)家族结合时，IRAKs被磷酸化而激活；激活的IRAKs从MyD88上脱离，然后IRAKs与其下游靶点TRAF6(TNF receptor associated factor 6)发生特异性结合。经过各级信号传递，IκB激酶(IκB kinase，IKK)激活，下游的NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)被磷酸化，IκB与NF-κB分离并进行泛素化，NF-κB变为激活状态(图1)。激活的NF-κB会促使TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子呈瀑布式释放，经血液循环进入肺组织。同时进入肺内的炎症因子，促进中性粒细胞的进一步聚集，中性粒细胞被激活并释放大量的溶酶体、氧自由基等造成肺微血管内皮细胞的直接损伤，最终导致ARDS发生发展。Ju M等人实验数据表明，过表达的miR-27a可直接靶向TLR4阻断其与LPS的结合，从而通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号轴改善小鼠肺部炎症和病理损伤[10]。近年来，很多研究发现，通过抑制NF-κB信号通路能实现减轻ARDS炎症反应，miRNA是抑制NF-κB信号通路的一个有效靶点。Zhu M等人研究表明TLR4是miR-182-5p的靶点，通过构建miR-182-5p过表达载体，证实miR-182-5p通过靶向TLR4阻断NF-κB信号通路，从而抑制ARDS的炎症反应和缓解肺部损伤[11]。Yang的研究揭示miR-106a通过结合TLR4的3'-UTR抑制TLR4的表达，当过表达miR-106a时明显抑制促炎细胞因子的分泌[12]。因此，在脓毒症诱导的ARDS的治疗中，我们可以从阻断TLR4/NF-κB信号传导通路出发，通过抑制ARDS中肺部炎症介质的释放，改善肺部炎症病理损伤，为临床上治疗脓毒症诱导的ARDS提供新的研究方向。

图1 miRNA在LPS诱导的ARDS中抑制TLR4激活的NF-κB通路及NLRP3炎性小体

二、miRNAs通过NLRP3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体调控脓毒症诱导的ARDS

NLRP3炎性小体是固有免疫的重要组分，可以活化炎症细胞、调控炎症细胞因子在促进ARDS的发生发展中，发挥重要作用。已有研究证实脓毒症诱导的ARDS患者血浆中caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平较正常者，均显著增高，由于NLRP3炎性小体是caspase-1、IL-1β及IL-18的上游，所以提示发生ARDS时NLRP3炎性小体被激活。已有研究表明，ARDS发生时，在肺泡巨噬细胞中，NF-κB信号通路被激活，NLRP3炎性小体被激活，使巨噬细胞表面的IL-1β表达上调，最终导致肺泡巨噬细胞焦亡，炎症加重。Zhang等为了验证miR-223/142与肺巨噬细胞的相互作用，他们将富集miR-223/142的微囊泡选择性靶向肺巨噬细胞，发现miR-223和miR-142分别通过抑制NLRP3和Asc蛋白协同抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活，减少炎性介质的释放，缓解ARDS[13]。

三、miRNAs介导外泌体的释放调控脓毒症诱导的ARDS

外泌体可由所有类型的细胞分泌，存在于细胞外、具有磷脂双分子层结构的囊泡[14]。外泌体包含功能蛋白、mRNA和miRNAs，外泌体包裹着它们分泌到细胞外，从而被传递到受体细胞而发挥细胞-细胞通讯的作用，从而调节受体细胞功能[15]。已有研究证实，循环外泌体中包含miRNAs[16]，例如内皮祖细胞来源的外泌体可以通过转移miR-126来减弱ARDS[17]。因此，外泌体逐渐被用作探索各种疾病新的治疗策略和药物传递载体，包括肺部疾病，外泌体能减轻肺泡水肿和肺损伤。

外泌体可以在各种细胞之间转移miRNAs，从而对细胞功能产生影响。因此，外泌体为ARDS的临床治疗提供了一个新的研究方向。Jiang K等人选择了与炎症相关的几种miRNAs，发现miR-155在经LPS处理的小鼠血清中表达最高，表明ARDS小鼠血清外泌体选择性的转载miR-155，证明ARDS小鼠的血清外泌体将miR-155转移到肺巨噬细胞中并激活NF-κB，诱导TNF-a和IL-6的分泌，从而诱发肺部炎症。此外，研究还发现血清外泌体来源的miR-155，分别通过靶向肌醇-5′-磷酸酶1的Src同源物2(Src homology 2-containing inositol-5′-phosphatase 1，SHIP1)和细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)促进肺巨噬细胞增殖和炎症反应[18]。在研究红景天苷(Salidroside，SAL)对ARDS的保护作用时，Zheng等人提取肺泡上皮细胞分泌的外泌体，发现分泌miR-146a可调控肺泡巨噬细胞的炎症通路[19]。LPS诱导miR-146a的表达降低，SAL通过抑制肺泡巨噬细胞中TLR4介导的NF-κB炎症通路及相关炎症因子的分泌，增加miR-146a在肺上皮细胞中的表达来治疗ARDS。Jiang L等人从内皮细胞(ECs)中提取外泌体，并进行鉴定，然后将外泌体注射到模型小鼠中，发现外泌体miR-125b-5p通过靶向拓扑异构酶Iiα(TOP2A)从而影响ARDS进展[20]。miR-125b-5p升高或内皮细胞源性的外泌体会促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而抑制LPS诱导的ARDS小鼠肺组织水肿、炎症反应和细胞凋亡。

lncRNA与脓毒症诱导的ARDS

lncRNA主要参与染色质修饰、mRNA衰变、选择性剪接以及顺式或反式转录调控等细胞功能[21]。lncRNA可以作为mRNA的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，在细胞内调控多种分子机制过程。目前已经证实lncRNA在急性肺损伤中发挥着重要作用。

ceRNA是一种细胞内RNA间相互作用的新基因表达调控机制。lncRNA-miRNAs-mRNA构成一个ceRNA网络，lncRNA通过与miRNAs应答元件(microRNA response elements，MRE)反向互补结合从而靶向miRNAs，进而间接调控mRNA的表达水平。各种微阵列分析表明，患者血浆中异常的ceRNA表达是ARDS的一个标志，肺微血管内皮细胞、肺泡上皮细胞以及巨噬细胞都被证实在ARDS中ceRNA表达异常。

一、lncRNA对肺微血管内皮细胞功能的调控

在ARDS的发病机制中，细胞因子介导的炎症过程也是内皮细胞(endothelial cells，EC)损伤的关键因素。肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)功能障碍是ARDS的始动环节。Qiu等人证实MiR-34b-5p是长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)的下游靶点，GRB2相关结合蛋白1(GAB1)是miR-34b-5p的靶蛋白。TUG1过表达抑制miR-34b-5p和上调PMVECs中的GAB1抑制脓毒症诱导的ARDS中的凋亡和炎症反应[22]。

二、lncRNA对肺泡上皮细胞功能的调控

越来越多的研究表明，ARDS的病理生理过程以肺泡上皮细胞(Alveolar epithelial cells，AECs)损伤为特征[23]，在ARDS中，AECs通过分泌炎症细胞因子和趋化因子参与炎症反应。Zhou等人在LPS诱导的ARDS小鼠模型的肺泡上皮细胞中，观察到长链非编码RNA核富集转录本1(lncRNA NEAT1)高表达，当敲低lncRNA NEAT1时，细胞活力增加、乳酸脱氢酶(LDH)释放减少、caspase-3/9活性降低，抑制肺泡上皮细胞的炎症反应。LPS诱导使高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及下游晚期糖基化终产物(RAGE)和p-p65/NF-κB的表达增加。然而，lncRNA NEAT1敲除抑制了这种现象。证实了lncRNA NEAT1的抑制可通过HMGB1-RAGE信号通路拮抗LPS诱发的肺泡上皮细胞急性损伤和炎症反应。广泛存在于肺泡上皮细胞中的FOXP2(Forkhead box p2)是一种转录抑制剂，抑制肺泡II型上皮细胞表面活性剂的分泌，参与ARDS的病理生理过程[24]。Nan等人发现肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)靶向miR-194-5p调控下游FOXP2的表达，从而抑制肺泡上皮细胞凋亡[25]。

三、lncRNA对肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage，AM)功能的调控

肺泡巨噬细胞是肺部防御病原微生物入侵和肺部损伤的第一道防线。外界损伤因素入侵肺部，肺泡巨噬细胞被激活。lncRNA通过ceRNA机制调控巨噬细胞的炎症反应参与ARDS的发展。Zhu J等人发现下调长链非编码RNA核内小RNA宿主基因14(SNHG14)可靶向miR-34-3p抑制Wnt1诱导信号通路蛋白(WISP1)来保护LPS诱导的ARDS[26]。Li等人研究证实MAP3K7结合蛋白2(TAB2)是miR-27b在细胞中的靶蛋白，级联蛋白2(CASC2)作为miR-27b的竞争性内源RNA，CASC2可直接与miR-27b结合。通过下调miR-27b可以增加TAB2的表达，从而保护肺组织免受LPS的损伤[27]。

circRNA与脓毒症诱导的ARDS

环状RNA(circRNA)是继miRNAs和lncRNAs之后的一类特殊的闭环型的非编码RNA分子,可影响ARDS中的细胞增殖、活化和凋亡性能。基于circRNA分子的稳定性、组织器官特异性等生物学特点，circRNA分子在确定ARDS的生物标志物和新的治疗靶点，具有重要作用。

研究者针对缺氧导致的HUVEC中circRNA的表达变化，发现circRNA在脓毒症ARDS的发病中可能有一定的作用。Bao等人通过盲肠结扎穿刺(CLP)诱导ARDS动物模型，发现与sham组小鼠相比，CLP小鼠肺匀浆中M1标记物(诱导型一氧化氮合酶和CD80)的比例显著增加[28]。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析显示，TGF-β信号通路与上调的circRNA相关。在这个研究中发现所有circRNA都具有miRNAs结合位点。上调chr17、chr14和chr18分别负向调控mmu-miR-7c-5p、mmu-miR-132-3p和mmu-miR124-3p的功能。所有这些miRNA都已被证实能够促进抗炎反应和M2极化。因此他们推测下调这些靶向miRNAs可以促进M1极化，加重肺损伤。并且，Bao等人的研究首次揭示了巨噬细胞活化中的circRNA表达模式。Shao等人建立了光气诱导ARDS大鼠模型，并进行了基因本体(Gene Ontology，GO)和KEGG分析，构建了调控网络来阐明间充质干细胞治疗光气诱导ARDS的分子机制，确定肺损伤的生物标志物和新的治疗靶点[29]。他们首次分析了lncRNAs、circRNAs和mRNA在光气诱导ARDS中间充质干细胞(MSC)处理后的异常表达谱。发现circRNA-3871靶向miR-339，circRNA3235靶向miR-320。这两种circRNA参与光气诱导的ARDS进展，并在MSCs治疗ARDS中发挥重要作用。

siRNA与脓毒症性诱导的ARDS

短干扰RNA(siRNA)是通过识别和降解特定mRNA序列来沉默目标基因。它为ARDS治疗开辟了一新的道路。但是，由于该技术具有免疫原性、不稳定性、毒性和跨越生物膜的困难等诸多障碍，目前应用受到了阻碍。siRNA专门靶向并下调其mRNA和相应的表达蛋白。siRNA“关闭”特定基因的能力使其具有吸引力[30]，从而开发出高度特异性的治疗方法。不幸的是，siRNA是一种阴离子分子，由于静电与生物膜上的阴离子磷脂相互排斥，无法单独穿过细胞膜。而且，裸siRNA分子被血清RNA酶快速降解，阻止其直接注射血液治疗。现在人们用了肽钉合技术，使天然肽更加结构化，能够抗蛋白酶降解，并且更具生物利用性，是用于siRNA递送的短载体[31]。

诱导多能干细胞(iPSCs)可以分化成体内所有的细胞类型。为了规避了异体移植引发的免疫排斥风险以及伦理和法律冲突等问题，可以用患者自身的体细胞制备诱导多能干细胞，用于某些特定疾病的治疗。Ju Z等人将尿液中的肾上皮细胞重新编程为人类诱导多能干细胞(hiPSCs)，并从hiPSCs中纯化外泌体作为RNAi传递系统。他们用pkh26标记hiPSCs外泌体，然后让其与人原代肺微血管内皮细胞(HMVECs)共培养发现hiPSCs外泌体可以被受体细胞以时间依赖的方式进行内化[32]。然后，用电穿孔法将siRNA引入到外泌体中，形成Exo/siRNA化合物。hiPSCs外泌体可作为天然基因载体，运输治疗性siRNA，从而减弱肺微血管内皮细胞内粘附分子-1的表达和中性粒细胞的粘附，缓解ARDS的炎症反应。

总结与展望

尽管最近的研究表明，miRNAs在体液中富集，并表明miRNAs可作为治疗ARDS的潜在靶点，但其临床应用仍有待深入研究。此外，人们越来越认识到新的miRNAs在ARDS的临床治疗和早期诊断中均具有重要意义。使用人类血清样本检测miRNAs是一种快速简单的检测方法。但这一领域目前的研究还都是在较小的患者队列中进行评估的，因此需要更大规模的患者队列研究来确定新的miRNAs用于临床的诊断和治疗。值得注意的是，一些研究还报道其他非编码RNA，如siRNA。siRNA对ARDS治疗具有重要意义，因为它具有抑制任何相关基因的潜力。尽管ARDS有广泛的研究和多个可能的靶点，但仍没有特异性的药物治疗方法。因此，通过siRNA进行基因沉默，可以为ARDS的临床治疗提供新的理论依据。

然而，无论是miRNAs还是siRNA，我们都是只关注miRNAs和siRNA对应的相关靶点，而缺乏系统的机制研究。因此，lncRNA-miRNA-mRNA构成的ceRNA研究就备受科研工作者的关注，通过lncRNA靶向miRNAs进而间接调控mRNA,系统研究ARDS的发病机制及临床治疗，将成为该疾病的一种潜在研究策略。