ICU常见肺部感染真菌支气管肺泡灌洗液G、GM实验诊断价值

沈勇 翁云龙 肖齐俊 李路 张文兵 邵敏

ICU治疗中应用糖皮质激素、广谱抗生素、机械通气等，均为发生侵袭性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infections， IPFI)的独立影响因素[1]，致病真菌对抗真菌药物的敏感性和耐药性有差异[2]。使用无效抗真菌药物治疗与完全没有接受治疗的患者死亡率相似，且延迟开始抗真菌治疗与增加死亡风险相关[3]。IPFI患者能否实现精准抗真菌治疗？真菌培养有孵育周期较长、检出率低、易受污染等缺点，典型CT影像学可作为辅助诊断依据之一，需结合基础疾病初步诊断[4]，血清真菌成分抗体、抗原PCR、二代基因测序等诊断技术临床普及尚任重道远[5]，有研究表明肺泡灌洗液G实验、GM实验对IPFI、侵袭性曲霉病早期诊断优于血清，且最佳诊断阈值分别为157 ng/L、1.08 μg/L[6]。故我们探讨IPFI真菌分布及各种真菌肺泡灌洗液G实验、GM实验诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

经安徽医科大学附属六安医院伦理委员会批准(2018LL-ky020)。选取2018年5月～2020年9月期间， 本院ICU和EICU收治的入院时有侵袭性肺部真菌感染(IPFI)高危因素患者96例，按照《重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南(2007)》执行[7]，具体简要如下：①有至少1项宿主因素，②有肺部感染症状，③且具有无菌术下取得的肺组织、胸腔积液、血液、下呼吸道标本组织病理学检出隐球菌、真菌菌丝、肺孢子菌包囊、滋养体、囊内小体或排除标本污染情况下培养出真菌生长二者之一。患者病情不能耐受纤支镜检查或可能短期内死亡、患者或家属不同意纤支镜或反复检测者排除，使用人血白蛋白等血制品、哌拉西林他唑巴坦及磺胺类抗生素、抗肿瘤药物等可能影响实验结果的患者需停药48 h，否则剔除。最终符合纳入标准并签署知情同意书患者中确诊IPFI 72例，其中男性42例，女性30例，年龄(59.6±11.6)岁，住院日数(17.9±4.9)日，基础疾病情况及构成比(见表1)。

表1 IPFI患者基础疾病分布及构成比

二、方法

1 标本采集 依据患者肺部CT影像学定位感染性病变所在地为目标肺段，在1、3、5日进行肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液进行G实验、GM实验、真菌培养、离心沉淀后显微镜下革兰染色和墨汁染色显影法镜检，同时抽取静脉血标本进行血清G实验、GM实验、血常规、CRP等检测。

2 菌株鉴定及分组依据直接镜检墨汁染色见圆形厚壁孢子、内有大小不等反光颗粒，尤其是外有肥厚的折光性荚膜，鉴定为隐球菌属。标本在沙保培养基，37℃温箱孵育48～72 h，最迟120 h未见真菌菌落生长为阴性。分离鉴定按《全国临床检验操作规程》，假丝酵母菌进行糖发酵实验、同化实验对真菌菌落形态进行进一步鉴别。

三、统计方法

结 果

一、真菌分布显微镜直接镜检出隐球菌5例，肺泡灌洗液真菌培养分离出5种89株真菌，分离率17.87%(95%CI：7.42%～40.23%)，其中白色假丝酵母菌分离率21.30%(95%CI：8.38%～42.15%)、光滑假丝酵母菌分离率16.95%(95%CI：6.53%～37.89%)、热带假丝酵母菌分离率12.35%(95%CI：5.45%～31.64%)、克柔假丝酵母菌分离率11.63%(95%CI：4.75%～29.97%)、曲霉菌7.24%(95%CI：3.88%～25.61%)。鉴定前五种主要致病菌属白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、曲霉菌、光滑假丝酵母菌、隐球菌分别占40.5%、22.47%、12.36%、11.23%、5.62%。详(见表2)。

表2 IPFI患者感染真菌分布及构成比

二、常见几种真菌肺部感染患者肺泡灌洗液G实验、GM实验各真菌种属组中，不同菌种属组间的血清、肺泡灌洗液G实验水平，以及血清、肺泡灌洗液GM实验水平差异均有统计学意义(P<0.001)。进一步的SNK-q两两比较发现，隐球菌和毛霉菌的血清、肺泡灌洗液G实验水平低于其他菌种(P均<0.05)，曲霉菌属的血清、肺泡灌洗液GM实验水平高于其他菌种(P均<0.05) 。详见(表3、4)。

表3 不同真菌种属血清、肺泡灌洗液G实验水平均值比较

表4 不同真菌种属血清、肺泡灌洗液GM实验水平均值比较

三、纳入本研究4例淹溺患者中2例痰涂片见酵母样真菌伴出芽，肺泡灌洗液G实验升高，GM实验升高不明显，培养为白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌各1例，另2例见痰中带暗红色出血，肺部CT见多发圆球形稍高密度病灶(详见附图1)，同时存在不对称肢体乏力，颅脑MR见多发圆球形病灶(详见附图2)，痰涂片见菌丝，肺泡灌洗液G实验、GM实验均升高，尤其GM实验升高明显，培养为烟曲霉、黑曲霉各1例。

图1 肺部曲菌感染CT影像

图2 脑部曲菌感染MR影像

讨 论

白色假丝酵母菌是单细胞真菌，是上呼吸道最常见的定植真菌之一，为条件致病真菌，在一项发展中国家研究发现在机械通气的第7天，有10%的患者出现血液念珠菌血症，真菌培养阳性的下呼吸道标本表明，有17%的患者发现了肺部的真菌入侵[13]。长时间使用广谱抗菌素引起菌群失调感染和机械通气等原因导致下呼吸道粘膜屏障破坏，同时使用糖皮质激素等免疫抑制剂，使酵母相得以向菌丝相转变，酵母菌出芽似菌丝伸展附着侵入组织，产生炎症反应，吞噬细胞介入细胞体液免疫，释放真菌细胞壁主要组分葡聚糖，故早期肺泡灌洗液G实验是重要的诊断手段，甚至早于血清G实验[14]。本研究还发现白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌同种属不同类真菌感染患者肺泡灌洗液和血清G实验水平比较差异无统计学意义，若非进行临床研究和耐药分析，进一步鉴定菌株的临床意义不大。

本研究发现IPA患者肺泡灌洗液、血清GM实验有诊断价值。曲霉菌属是丝状真菌，半乳甘露糖是其细胞壁组成成分一种，在免疫功能不全患者，如肺移植后患者的呼吸道中定植曲霉菌在下呼吸道生长较快，菌丝穿透血管，引起血管炎及血管周围炎，可血栓形成，炎症细胞参与吞噬、消化并释放半乳甘露糖。Shahid Husain等[15]研究表明使用支气管肺泡灌洗培养法和半乳甘露聚糖检测方法的使用显著降低了肺移植患者侵袭性曲霉病的延迟治疗风险，与常规预防方法相比，抗真菌暴露量降低了50%。

国内外对淹溺并发侵入性肺真菌感染研究和报道较少，本研究有4例淹溺患者纳入研究，均系严重淹溺，入院时并发急性呼吸窘迫综合征(ARDS),同时存在机械通气、早期使用糖皮质激素情况，且早期抗感染未覆盖真菌，临床表现为持续中度发热，其中2例痰涂片见酵母样真菌伴出芽，肺泡灌洗液G实验升高，GM实验升高不明显，培养为白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌各1例，可能与有创机械通气和激素使用，造成上呼吸道定植酵母菌条件下侵入下呼吸道感染；另2例临床见痰中带暗红色出血，肺部CT、颅脑MR见多发感染脓肿病灶，痰涂片见菌丝，肺泡灌洗液G实验、GM实验均升高，尤其GM实验升高明显，培养为烟曲霉、黑曲霉各1例，符合IPA易侵袭血管引起出血及经血液远处播散感染的表现，且此2例患者发病时淹溺均吸入非流动污水，符合吸入致病性曲霉菌混合感染的致病机制，肺部影像学与肺泡灌洗液G实验、GM实验相结合，有利于IPA的早期诊断。

国外新型隐球菌动物模型研究，从吸入隐球菌真菌颗粒，气道常驻细胞识别、招募对新型隐球菌的先天免疫、晚期适应性细胞介导的对新型隐球菌的免疫，再到潜伏真菌感染的再激活模型：肉芽肿遏制的分解，提示多发生免疫功能低下人群[16]。本研究发现隐球菌感染患者无论是真菌培养、血清、肺泡灌洗液G实验、GM实验检出率均不高，可能是因为隐球菌是条件致病真菌，在免疫低下患者中感染机率加大，且多为亚急性或慢性深部局限性感染，菌体有厚的荚膜，在非进展成播散感染的严重阶段，肺泡灌洗液和血清G实验水平一般较低，与国外隐球菌致病机制研究基本符合。吴欢欢等在25位艾滋病并发肺部隐球菌感染接受测试的患者中，有23位(92.00%)在血清隐球菌荚膜多糖抗原测试中呈阳性[17]，在缺乏对真菌抗原进行检测的基层医院，对呼吸道标本的反复墨汁染色镜检可能有直接和有利诊断。毛霉菌性肺炎临床表现无特异性 ,早期呼吸道组织标本病理学证据对于诊断尤为重要[18]。肺部毛霉菌感染患者血清、肺泡灌洗液G实验、GM实验水平低下，可能因为例数少代表性差，且毛霉菌为结合菌属，真菌细胞壁不含葡聚糖和半乳甘露糖，故这种成分检测实验无诊断价值。

在侵袭性肺部真菌感染的早期诊断中，对真菌细胞壁成分实验检测是一项重要的实验室诊断技术，但是考虑到感染不同种属真菌存在微生物学差别以及在感染中病理生理学特点不同，G实验诊断假丝酵母菌，G实验联合GM实验诊断曲霉菌属有临床价值，二者对新隐球菌、毛霉菌诊断价值不大。