间隙连接蛋白45与结直肠癌患者的临床病理特征及预后的相关性分析

朱建华， 钱筱健， 顾梦会， 袁 政

(江苏省苏州市立医院肠胃外科， 江苏 苏州 215002)

结直肠癌发病率居我国消化系统恶性肿瘤第五位，近年来其发病率呈上升趋势，且约有1/3的患者确诊时临床分期已达到Ⅲ期或出现淋巴结转移[1]。尽管手术技术、化疗药物的发展使结直肠癌患者生存率得到显著提高，但结直肠癌患者根治术后复发率仍高达20%～45%，是影响患者远期预后的重要原因[2]。随着精准医疗理念的愈发深入，越来越多的学者开始尝试探索评估结直肠癌患者预后的精准指标，并明确影响患者临床病理特征、预后的相关因素，以期评估患者复发、转移风险，进而指导个体化治疗[3]。间隙连接蛋白45(Cx45)是Cx家族的成员之一，其基因属第二类抑癌基因，既往研究显示，Cx45表达异常与鼻咽癌发病及进展有关[4]。此次研究采用组织芯片技术就结直肠癌患者Cx45表达进行检测，旨在借助组织芯片大规模、高通量、标准化的优势，明确Cx45在不同细胞及组织内表达情况，了解其与患者临床病理特征、预后的关联，为结直肠癌患者预后预测及个体化治疗提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象：选择本院2016年1月至2019年1月收治的97例结直肠癌患者，开展病例对照研究。病例入组标准：①经肠镜及病理组织学检查明确结直肠癌诊断：病理组织标本镜下检查可见结直肠黏膜上皮来源，具有恶性形态学特征的细胞和(或)结构，穿过黏膜肌层、浸润黏膜下层；②符合结直肠癌外科手术治疗指证；③入组前未接受结直肠癌相关外科治疗或放化疗等治疗；④具备配合研究的能力及意愿。排除标准：①入组前4周内出现感染或急性炎症；②入组前1周内有抗凝或促凝药物使用史；③合并其他部位恶性肿瘤；④合并心、肾等脏器严重功能不全；⑤复发或转移性结直肠癌。97例患者中，男53例，女44例，年龄54～86岁，平均(72.95±5.71)岁，肿瘤直径2.6～8.1cm，平均(5.51±0.36)cm。本研究已征得我院医学伦理委员会批准，并获取患者知情同意。

1.2研究方法：97例患者均接受结直肠癌根治术治疗。术中取其病灶组织、癌旁组织及转移淋巴结组织，以4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋、连续系列切片，每隔10片取连续4片，厚度6μm，以多聚赖氨酸载玻片贴片。将97份组织蜡块切成厚度4μm的切片，使用烘箱以60℃烤片1h，行HE染色。显微镜下对病灶组织、癌旁组织及转移淋巴结组织进行标记，切片后分别转移至载玻片上，完成组织芯片制作。将组织芯片置入烘箱内，以60℃烤片1h，行二甲苯、梯度乙醇脱蜡水化；向蒸锅内加入枸橼酸钠0.01moL，加热至95℃，放入组织芯片，加热5min完成抗原热修复，自然冷却；使用PBS溶液漂洗5min，重复3次后滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育30min后加入兔抗人Cx45单克隆抗体(1∶100)，以4℃孵育过夜。取出标本，复温后以PBS溶液漂洗5min，重复3次后加入生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶200)室温孵育1h，漂洗3次后加入SABC孵育1h，再次漂洗3次，行DAB显色、苏木素复染、PBS返蓝，以及梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封固处理。观察病灶组织、癌旁组织及转移淋巴结组织细胞膜、细胞质Cx45阳性染色情况，阳性染色呈淡黄色、黄色或棕褐色，染色强度淡黄色判定为低表达，计1分，黄色为中表达，计2分，棕褐色为高表达，计3分。此外，通过电话随访、门诊随诊等方式，对患者进行长期随访，随访时间≥3年，记录患者随访期间总生存时间(OS)、无进展生存时间(PFS)，PFS定义为患者从接受治疗开始，至观察到疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的这段时间。

2 结 果

2.1结直肠癌患者病灶组织、癌旁组织、转移淋巴结组织Cx45表达情况：共获取病灶组织、癌旁组织各97份，转移淋巴结组织86份。病灶组织、转移淋巴结组织Cx45表达情况比较，未见统计学差异(P>0.05)，病灶组织、转移淋巴结组织Cx45高表达率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 结直肠癌患者病灶组织癌旁组织转移淋巴结组织Cx45表达情况n(%)

2.2不同临床病理特征患者病灶组织Cx45表达情况：不同淋巴结转移、不同分化程度、不同TNM分期直肠癌患者病灶组织Cx45表达情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征患者病灶组织Cx45表达情况比较n(%)

2.3不同病灶组织Cx45表达患者预后：病灶组织Cx45高表达患者OS及PFS均较中低表达者更短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同病灶组织Cx45表达患者预后比较

2.4影响因素分析：Cox回归模型结果显示，有淋巴结转移、分化程度低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病灶组织Cx45高表达均为影响结直肠癌患者OS的独立危险因素(P<0.05)。见表4、表5。

表4 多因素Cox回归分析赋值表

表5 影响结直肠癌患者OS的多因素Cox回归分析结果

3 讨 论

恶性肿瘤的发生及进展伴随着大量复杂的生理及病理变化，并以致癌基因激活、肿瘤微环境形成为主，上述变化直接影响着细胞增生，并诱导病变向恶性转化[5]。既往研究显示，间隙连接蛋白在消化道黏膜损伤至组织化生、癌变过程中发挥了重要影响：多个同型或异型间隙连接蛋白单体可共同构成细胞间隙连接通道，为小分子和代谢产物的通过提供路径，进而调控细胞的生长、分化及凋亡[6]。其中，Cx26表达水平的下调被认为与结直肠癌患者预后较差有关[7]。

此次研究就结直肠癌患者Cx45表达情况进行了检测，结果显示，与癌旁正常组织相比，结直肠癌病灶及转移淋巴结组织Cx45高表达率均更高，说明Cx45表达上调与结直肠癌的发生发展有关，其机制可能与成纤维细胞活化所致Cx45表达水平上升有关[8]。同时，高表达Cx45可实现Wnt信号的负反馈调节，重建细胞间隙连接，发挥一定的抗肿瘤细胞增殖作用[9]。本研究结果显示，出现淋巴结转移、病灶组织低分化，以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ结直肠癌患者病灶组织Cx45表达水平更高，在印证上述结论的同时，也表明Cx45可能是结肠癌重要的促癌因子[10]。动物实验表明，敲除Cx45基因有助于抑制人高转移性肝癌细胞株的增殖和侵袭[11]，表明Cx45有望成为恶性肿瘤的重要治疗靶点之一，针对结直肠癌患者研发下调Cx45表达水平的靶向治疗方案，将有望为患者预后的改善提供新的思路。

为印证Cx45表达水平与结直肠癌患者预后的影响，此次研究就Cx45高表达、中低表达患者OS、PFS进行了比较，结果显示，Cx45高表达者OS及PFS均更短，说明Cx45高表达与结直肠癌的发生发展密切相关，其机制可能为：Cx45在细胞缝隙连接通讯(GJIC)环节可能发挥抑制作用，Cx45表达的上升伴随着细胞与正常分化、增殖轨道的脱离，进而导致正常GJIC无法形成、GJIC功能无法有效发挥，此时正常结直肠黏膜细胞趋向于出现恶性、转移潜能，恶性肿瘤发生风险也随之上升[12,13]。同时，有学者发现，Cx45不仅可增强肿瘤细胞侵袭力、附着力，也是诱导肿瘤细胞迁移的重要因子[14]。因此，病灶组织Cx45高水平表达可能导致结直肠癌患者根治性切除术后复发、转移风险上升，进而直接对患者预后产生负面影响[15]。本研究Cox回归分析结果显示，除淋巴结转移、分化程度、TNM分期等公认指标外，病灶组织Cx45高表达也使患者预后不良风险上升36.416倍，印证了上述结论。

综上所述，不同淋巴结转移、分化程度、TNM分期结直肠癌患者病灶组织Cx45表达存在明显差异，除临床病理特征外，病灶组织Cx45高表达也与患者OS缩短直接相关。在今后的临床实践中，可尝试基于病灶组织Cx45表达状态评估患者预后并指导个体化诊疗策略的制定，同时进一步探索抑制Cx45表达的靶向治疗方案，将有望为结直肠癌的临床治疗提供新的思路。