昆明地区1 452例低病毒载量慢乙肝患者耐药突变相关位点的分析

余婷婷，王红英，张润武，白经，普冬，李冬玲

（昆明市第三人民医院/云南省传染性疾病临床医学中心，云南 昆明 650041）

2016 年世界卫生组织提出“2030 年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁”的目标。云南病毒性肝炎发病率跟全国的总体情况差不多，截至2022 年2 月，云南省共报告法定传染病15 912例，其中共报告16 种乙类传染病，病毒性肝炎的报告发病数居第2 位，而乙肝在病毒性肝炎里占比最高，乙肝的诊疗水平也亟待提高。临床上低病毒载量乙肝患者分布比例高，即便乙肝病毒在低水平复制状态下病毒仍有对人体肝脏造成损伤的能力，长期以往亦会影响患者的预后，甚至导致其死亡[1]。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]放宽了抗病毒治疗的适应证，过去对于乙肝患者要求转氨酶超过2 倍上限，E 抗原阳性的，HBV DNA ＞ 104IU/mL，E 抗原阴性的，HBV DNA ＞103IU/mL，才开始抗病毒治疗，现在不再对HBV载量提出要求，只要检测结果为阳性，ALT 升高（排除其他原因），就推荐开始抗病毒治疗，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒载量乙肝患者也纳入抗病毒治疗人群。不同基因型和抗病毒治疗方案对乙肝患者病情发展以及预后有重要影响，本研究通过对昆明地区低病毒载量乙肝患者进行基因分型及耐药性研究，为临床抗病毒治疗难易程度的判定及抗病毒精准医疗个体化方案的制定提供依据，致力于2030 年全球消除病毒性肝炎目标的推进。

1 资料与方法

1.1 入选标准

选取2020 年1 月至2021 年12 月昆明市第三人民医院门诊及住院的1 452例低病毒载量（HBV DNA《2.0×103IU/mL）慢性乙型肝炎患者，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]。

1.2 标本采集

慢性乙型肝炎患者空腹采集不抗凝静脉血5 mL，3 000 r/min 转速离心 10 min，分离血清置于 1.5 mL 离心管中，于-20 ℃储存，备用。

1.3 标本检测

乙肝病毒载量检测：按照罗氏COBAS TaqMan的试剂盒操作说明进行检测。

乙肝病毒分型和耐药基因位点检测：血清标本中提取HBV DNA，PCR 扩增 HBVP 区 RT 段序列，扩增产物纯化后，在ABI 3500DX 测序仪上进行双脱氧末端终止法Sanger 测序。操作按说明书严格进行。

1.4 序列分析

通过序列比对，分析乙肝病毒基因型以及HBV P 区核苷类药物拉米夫定LAM、阿德福韦酯ADV、恩替卡韦ETV、替比夫定LDT、替诺福韦酯TDF、恩曲他滨FTC 等相关耐药位点基因的突变情况。参照《2017 年欧洲肝病年会乙型肝炎病毒感染临床实践指南要点》[3]判读耐药敏感性。

1.5 统计学处理

采用SPSS15.0 对检测数据进行统计分析，计数资料用n（%）表示。

2 结果

2.1 昆明地区乙肝低载量人群分布特征

昆明地区乙肝低载量人群中HBeAg 阴性者占比较高（59.5%），男性患者占比（70.6%）高于女性，年龄分布以30～60 岁为主，占比72.7%，C 基因型患者占比最高（61.8%），检出D 基因型患者2例，见表1。

表1 昆明地区乙肝低载量人群分布特征Tab.1 Population distribution characteristics of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.2 昆明地区低载量乙肝患者耐药分布情况

1 452例昆明地区低载量乙肝患者中共有37例患者检出耐药突变位点，拉米夫定与恩曲他滨耐药率一致（1.6%），替比夫定耐药率为1.2%，阿德福韦耐药率0.9%，恩替卡韦耐药率0.2%，替诺福韦未检出耐药突变位点，见表2。

表2 昆明地区低载量乙肝患者耐药分布情况Tab.2 Drug resistance distribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.3 昆明地区低载量人群耐药位点检出情况

37例检出耐药突变位点的低载量乙肝患者中，检出阿德福韦耐药相关主要位点A181T/V、N236T、M204V/I；替比夫定耐药相关主要位点M204V/I、A181T/V，补偿位点L180M；恩替卡韦耐药相关主要位点M204V，补偿位点L180M、V173L，其他位点S202G；拉米夫定耐药相关主要位点M204V/I、A181T/V，补偿位点L180M、V173L；恩曲他滨耐药位点与拉米夫定一致。各药物的耐药位点模式，见表3。

表3 昆明地区低载量人群耐药位点分布情况Tab.3 Drug resistance sitesdistribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.4 其他突变位点检出情况

除耐药突变位点外，1 452例昆明地区低载量乙肝患者中还检出其他突变位点112例，其中S256G、S213T、N/H238T/D、Q215H 检出率最高，检出率最低的突变位点为A194T，共检出2例，见表4。

表4 其他突变位点检出情况Tab.4 Detection of other mutation sites

3 讨论

本研究中，昆明地区低病毒载量乙肝患者多为男性，与本研究团队前期对昆明地区2 707例慢性乙肝患者的研究结果相一致[4]，这可能与男性社交范围较女性更广，感染HBV 的机会更大。低病毒载量乙肝患者年龄段多集中在30～60 岁，占比72.7%，可能与此年龄段人群社会活动程度相对较高、经济能力相对较强有关，他们获取健康普及知识的渠道更为广泛，因此就诊率相应增高[5]。我国HBV 基因型分布存在南方以 B 型为主，北方以 C 型为主的地域性差异。而对于昆明地区低病毒载量乙肝患者的研究发现，C 基因型患者占比61.8%，B 型占比38.1%，D 基因型患者2例，占比0.1%，说明本地区低病毒载量乙肝患者基因型以C 型为主，这与张悦等[6]的研究结果相一致，提示本地区的 HBV 基因型分布状况有独立特征。这可能与昆明为云南省会城市，人口流动性大，HBV 的传播途径及感染人群等都在发生变化，造成基因型分布出现多样化的趋势。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]不再对HBV 载量提出要求，只要检测结果为阳性，ALT 升高（排除其他原因），就推荐开始抗病毒治疗，治疗药物首选强效低耐药的核苷类药物 NAs，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒载量乙肝患者也纳入抗病毒治疗人群。本研究中，1 452例低病毒载量乙肝患者中HBeAg 阴性人数占比较高（59.5%），临床实践中，部分低载量乙肝患者HBeAg 阴性，病毒复制处于静止状态，但HBeAg 转阴也可能是由HBV 的变异所引发，此时病毒更易对临床抗病毒药物耐药[7]，提示临床治疗过程中更应对低载量乙肝患者耐药情况予以关注。

本次1 452例昆明地区低载量乙肝患者中共有37例患者检出耐药突变位点。拉米夫定是第一代核苷类逆转录酶抑制剂，体内与体外研究表明拉米夫定与恩曲他滨耐药位点一致，本研究中拉米夫定与恩曲他滨耐药率一致，耐药率为1.6%，耐药相关主要位点M204V/I、A181T/V，补偿位点L180M、V173L，这与许春、赵卫峰等[8-9]的研究结果相一致。本研究中，与拉米夫定相比，替比夫定的耐药率略低，但替比夫定耐药率高于阿德福韦、恩替卡韦，其中以恩替卡韦的耐药率最低。恩替卡韦耐药率低，具有较高的耐药屏障，这可能与恩替卡韦的耐药机制不同于其他NAs 药物有关，需要在先出现M204V +L180M 两个位点的耐药突变后，再出现补偿位点或其他位点的联合变异，从而产生 ETV 耐药。以往的临床研究中[10-11]，尚未发现 TDF 耐药产生，与本研究结果类似。但N236T、A194T 和A181T/V 位点突变会引起替诺福韦酯不敏感[12]，本研究中发现N236T位点变异2例，A194T 位点变异2例，A181T/V位点变异12例，提示昆明地区低载量乙肝患者可能存在替诺福韦酯药物敏感性下降。此外，本研究中还发现2 种或2 种以上的核苷类药物可能存在交叉耐药位点，临床应用有待进一步研究探讨。

除耐药突变位点外，1 452例昆明地区低载量乙肝患者中还检出其他突变位点112例。其中，检出N/H238T/D 位点18例（占比16.1%），Q215H位点16例（占比14.3%），I233V 位点8例（占比7.1%），还检出V214A、V191I 各4例。与Ryu 等[13]的研究相似，他们的研究还发现这5 个位点的出现可能会导致阿德福韦耐药敏感性下降。此外，本研究还发现V207M 位点10例（占比8.9%）、S213T 位点18例（占比16.1%），Jiang 等[14]对79例单用阿德福韦治疗的阿德福韦耐药者研究也发现了 V207 M、S213 T18例等位点的变异。L229V位点本研究中发现10例（占比8.9%），Han 等[15]对46例替比夫定变异患者进行基因测序发现34例患者也L229V 等变异位点。本研究中，除上述位点外，还发现V191I、A200V、S256G 突变位点的存在，而这些位点相关文献报道极少。上述检测出的所有突变位点是否与耐药性相关，能否引起药物敏感性降低，仍存在一定的争议，但其检出率存在一定的占比，也应引起重视，还需要更多学者持续深入的研究，提供一些客观的数据支撑，从而能促使新的耐药位点得到认定。

耐药突变是阻碍慢性 HBV 感染治疗的一项重大难题，需进一步深入研究昆明地区低病毒载量乙肝患者耐药突变位点情况，结合肝纤维化程度、丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平、乙肝病毒DNA 水平等多指标联合检测，为低载量慢乙肝患者的诊断和疗效动态监测提供更准确的临床依据，判定患者抗病毒治疗难易程度，制定抗病毒精准医疗个体化方案，从而致力于推进2030 年全球消除病毒性肝炎目标的实现。