miR-125a-3p 对动脉粥样硬化斑块及M1/M2巨噬细胞、MMP-9 和VEGF 的影响

刘演龙，光雪峰，尹小龙，戴海龙

（昆明医科大学附属延安医院心内科/云南省心血管疾病重点实验室/云南省心脏疾病临床医学中心，云南 昆明 650051）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症主导的疾病，其首要驱动因素是巨噬细胞表型失调[1]。激活的巨噬细胞主要被极化成两种表型，经典激活的M1 和间接激活的M2 巨噬细胞，启动并促进炎症是M1 巨噬细胞的主要作用，而M2 巨噬细胞的主要作用为抑制炎症[2]。在炎症的早期启动中，由于各种炎症因子的诱导，M1 巨噬细胞被大量激活，能够有效清除病原体；随着炎症进展，激活了大量的M2 巨噬细胞，炎症反应被抑制[2-3]。Schmitz 等[4-5]发现，M2 巨噬细胞主要存在于稳定性动脉粥样硬化斑块中，而M1巨噬细胞主要存在于不稳定性动脉粥样硬化斑块中，提示斑块的不稳定可能是由于M1 和M2 之间失衡。

MicroRNA 在单核细胞向巨噬细胞分化过程中起着重要的调控作用。最近研究显示，随着单核细胞分化为M1 巨噬细胞，miR-125a-3p 和miR-125a-5 在此过程中也表达升高。M1 巨噬细胞比例的升高，M1/M2 巨噬细胞的分化失衡，导致不稳定斑块的形成[6-7]。研究发现MMP-9、VEGF 在不稳定斑块中呈高表达[8-9]，并且MMP导致巨噬细胞积累，VEGF 将巨噬细胞诱导为M1巨噬细胞[10-11]，表明MMP-9、VEGF 在不稳定斑块中起重要作用。笔者的研究[12]显示miR-125a-3p 在动脉粥样硬化斑块的不稳定及破裂中也起着重要的作用。本研究拟进一步在动物体内实验，观察miR-125a-3p 抑制剂对动脉粥样硬化斑块形成、M1/M2 巨噬细胞以及斑块组织中MMP-9 和VEGF 表达的影响，以探讨其在动脉粥样硬化斑块的稳定性中的作用，为不稳定斑块的防治提供新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

15 只成年雄性健康日本大耳兔，体重2～2.5 kg，由昆明医科大学实验动物学部提供。本研究经医院伦理委员会审批，实验动物的处理符合实验动物相关要求。

1.2 主要试剂和仪器

牛血清白蛋白（Solarbio）、0.5% 胆固醇，l0%蛋黄，5% 猪油、miR-125a-3p 干扰慢病毒载体（广州复能基因有限公司）、生理盐水、甲醛溶液、70%乙醇、4% 中性福尔马林、油红O 染液、0.01M 的PBST、2%BSA、CD11c抗体（Affinity）、CD206抗体（Affinity）、VEGF抗体（Santa Cruz Biotechmology）、MMP-9 抗体（Solarbio）。Axio Lab A1 显微镜（蔡司）、Axio Observer A1 荧光显微镜（蔡司）。

1.3 实验方法

1.3.1 兔动脉粥样硬化模型的建立及miR-125a-3p 抑制剂干预15 只成年雄性健康日本大耳兔，给予普通饲料和水适应性喂养7 d，再将其随机分为3组，对照组、动脉粥样硬化模型组（AS 模型组）和miR-125a-3p 抑制剂干预组（miR-125a-3p抑制剂组）。对照组给以普通饲料喂养，动脉粥样硬化模型组和miR-125a-3p 干预组一次性静脉注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），即日起给予（0.5% 胆固醇，l0% 蛋黄，5% 猪油）150 g/d 喂养2 周，给予动脉粥样硬化模型组和miR-125a-3p干预组第2 次注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），并继续给予高胆固醇饲料喂养。期间，所有组提供充足干净水，定期打扫和清洗兔笼。分别于动脉粥样硬化建立4 周和8 周后，miR-125a-3p 干预组注射以miR-125a-3p 干扰慢病毒载体（5 mL/只），对照组和动脉粥样硬化模型组注射以等量生理盐水，12 周时耳缘静脉注射空气处死兔子，立即剖开胸、腹腔，游离主动脉全长，剥离外膜脂肪组织，纵行剖开，行以下述处理。

1.3.2 血管内膜油红“O”染色血管粥样斑块大体标本染色步骤（1）从甲醛溶液中取出标本，用流水洗15 min，剥去外膜，再用蒸馏水浸洗；（2）取储备液60 mL 加入蒸溜水至100 mL，混匀放置10 min 后染色，染色时间为2～4 min；（3）用70%乙醇浸泡标本至斑块呈红色，底色呈白色为止，最后用蒸馏水浸泡标本，浸入甲醛溶液中保存。油红O 染液的配制：储备液：油红O 0.5 g，98%异丙醇 100 mL。临用前取上液6 mL，加蒸馏水4 mL，静置10 min，过滤即可。

1.3.3 免疫组织化学方法检测斑块组织中MMP-9、VEGF主动脉经4% 中性福尔马林固定后，石蜡切片进行MMP-9、VEGF 表达测定（SP 法，阴性对照一抗用0.01 mol/L PBS 代替）。显微镜下拍照后用“Image Pro Plus 4.5”软件进行图像分析，测定阳性物质表达面积和积分光密度。

1.3.4 免疫荧光法检测M1 标志物CD11c、M2标志物CD206 石蜡切片经脱蜡、酒精脱水后，进行抗原修复，用0.01 M 的PBST 漂洗5 min，重复3 次；以2% BSA 于37 ℃湿盒内封闭30 min；标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体，放在湿盒中，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS 漂洗5 min，重复3 次，不时震荡。缓存甘油封片，镜检。

1.4 统计学处理

SPSS 11.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较应用方差分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管内膜油红“O”染色结果

血管内膜油红“O”染色显示，动脉粥样硬化病变处被染成红色。血管内膜油红“O”染色统计结果显示动脉粥样硬化组病变区域远大于miR-125a-3p 抑制剂干预组，各组间的差异具有显著性（P＜ 0.01）（图1、图2）。结果表明：miR-125a-3p 抑制剂能减少动脉粥样硬化斑块的形成。

图1 血管内膜油红“O”染色各组动脉粥样硬化病变区域Fig.1 Vascular intima oil red "O" staining for atherosclerotic lesions in each group

图2 血管内膜油红“O”染色Fig.2 Vascular intima is stained with oil red "O" stain

2.2 免疫组织化学方法检测斑块组织中MMP9的结果

MMP-9 免疫组化染色结果显示，与对照组比较，AS 模型组的MMP-9 水平显著升高（P＜0.001），与AS 模型组比较，miR-125a-3p 抑制剂干预后MMP-9 水平显著下降（P＜ 0.01）（图3、图4）。结果表明：miR-125a-3p 抑制剂干预后，降低了斑块组织中MMP-9 的表达。

图3 免疫组化检测各组MMP-9 表达水平Fig.3 The expression level of MMP-9 was detected by immunohistochemistry

图4 MMP-9 免疫组化染色（×200）Fig.4 MMP-9 immunohistochemical staining（×200）

2.3 免疫组织化学方法检测斑块组织中VEGF 的结果

VEGF 免疫组化染色结果显示，与对照组对比，AS 模型组的VEGF 水平显著提高（P＜ 0.01）；与AS 模型组对比，miR-125a-3p 抑制剂干预后VEGF 水平下降，（P＜ 0.01）（图5、图6）。结果表明：miR-125a-3p 抑制剂干预后，降低了斑块组织中VEGF 的表达。

图5 免疫组化检测各组VEGF 表达水平Fig.5 Immunohistochemistry was used to detect VEGF expression levels in each group

图6 VEGF 免疫组化染色（×200）Fig.6 VEGF immunohistochemical staining（×200）

2.4 免疫荧光染色检测M1 标志物CD11c 的结果

免疫荧光检测M1 标志物CD11c 染色结果显示：与对照组比较，AS 模型组的CD11c 水平有明显升高（P＜ 0.000 1）；与AS 模型组比较，miR-125a-3p 抑制剂干预后CD11c 水平显著下降（P＜0.000 1）（图7、图8）。结果表明：miR-125a-3p抑制剂减少了斑块组织中M1 巨噬细胞。

图7 免疫荧光检测各组M1 标志物CD11c 表达水平Fig.7 The expression level of M1 marker CD11c was detected by immunofluorescence

图8 M1 标志物CD11c 免疫荧光染色（×200）Fig.8 M1 marker CD11c immunofluorescence staining（×200）

2.5 免疫荧光染色检测M2 标志物CD206 的结果

免疫荧光检测M2 标志物CD206 染色结果显示，与对照组对比，AS 模型组的CD206 水平显著下降（P＜ 0.000 1），miR-125a-3p 抑制剂干预后CD206 水平明显升高（P＜ 0.000 1）（图9、图10）。结果表明：miR-125a-3p 抑制剂增加了斑块组织中M2 巨噬细胞。

图9 免疫荧光检测各组M2 标志物CD206 表达水平Fig.9 The expression level of M2 marker CD206 was detected by immunofluorescence

图10 M2 标志物CD206 免疫荧光染色（×200）Fig.10 M2 marker CD206 immunofluorescence staining（×200）

3 讨论

AS 是一种慢性炎症性疾病，严重威胁人体健康。研究表明，不稳定AS 斑块容易导致不良心血管事件的发生[13-14]。巨噬细胞是AS 病变中主要的免疫细胞，在AS 整个病理生理过程中都发挥着重要作用[5]。在动脉粥样硬化中，当循环中的单核细胞进入内膜后，单核细胞会分化为巨噬细胞[15]。巨噬细胞和单细胞暴露在炎症细胞因子、氧化脂质、胆固醇晶体和其他因素中。所有这些刺激不仅诱导特定的转录反应，而且还广泛相互作用，导致动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的转录[7]。基于不同的激活方式，巨噬细胞主要分为两种表型，即经典激活的M1 和替代激活的M2 巨噬细胞[2-3]。M1 巨噬细胞能够开始并维持炎症反应，分泌促炎细胞因子，激活内皮细胞，并诱导其他免疫细胞募集到发炎组织中;另一方面，M2巨噬细胞促进炎症的消退，吞噬糖凋亡细胞，驱动胶原蛋白沉积，协调组织完整性，释放抗炎介质，主要参与组织修复，具有吞噬、促血管生成和促纤维化能力。M1 巨噬细胞在促进斑块不稳定方面发挥了重要作用，而M2 巨噬细胞则维持斑块的稳定，提示斑块的不稳定可能是M1 和M2亚型之间失衡的结果[6,16]。

miRNA 是一种小型、进化保守的非编码RNA，长度为18～25 个核苷酸，在基因调控中具有重要作用，转录后调控基因表达[17-18]。miRNA 可以抑制数千个目标基因并协调正常过程，包括细胞增殖、分化和凋亡[19]。同时，miRNA 对巨噬细胞的激活起到重要调节作用[7]，例如Lin-Li Lv 等的研究表明[20]，外体miR-19b-3p 调节的TEC 和巨噬细胞之间的通路，导致M1 巨噬细胞激活。由于M1 巨噬细胞加剧斑块的不稳定，因此，笔者可以推测miRNA 对不稳定斑块的发生起到了一定的作用。笔者的研究[12]也提示miR-125a-3p 在动脉粥样硬化斑块的不稳定及破裂中起着重要的作用。

VEGF 是一种有效的内皮细胞生长因子和血管生成诱导因子，对血管的完整性和血管功能具有重要意义。研究发现，VEGF 在不稳定斑块中发挥着重要作用，能在一定程度上加速动脉粥样硬化斑块的进展和不稳定性。其机制可能是VEGF 增加血管通透性，引起红细胞外渗，进而导致斑块内出血，加速动脉粥样硬化[21]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）属于MMP 家族，并已被广泛研究。随着MMP-9 活性的增加，MMP-9 可导致纤维帽变薄，从而导致斑块的不稳定[22]。

本研究结果显示，抑制miR-125a-3p 可使动脉粥样硬化斑块病变区域面积减少，斑块组织中M1 巨噬细胞、MMP-9，VEGF 表达减少，M2 巨噬细胞增加。提示miR-125a-3p 抑制可以减轻动脉粥样硬化斑块形成，平衡M1/M2 巨噬细胞，减少MMP-9，VEGF 表达，促进斑块稳定，miR-125a-3p 可能是治疗不稳定动脉粥样硬化斑块的新靶点。