趋化因子CXCL12及其配体CXCR4、CXCR7对HER2阳性乳腺癌细胞生物学功能的影响①

蒋雅玲 胡学丽 陈 辉 段 智 刘 景 范先成（长沙市第一医院乳甲外科，长沙 410005）

乳腺癌不仅是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤，同样也是女性癌症死亡的最主要原因［1-2］。流行病学调查显示，在过去的30年间，乳腺癌在我国的发病率以每年3%～5%的速度快速增长，且日趋年轻化，据预测，截至2021年，我国30～49岁的女性乳腺癌患者将达到220万，相当于每10万名女性中将新增100多例患者［3］。而在乳腺癌中，人类表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌亚型虽然仅占乳腺癌的15%～20%，但临床数据表明，与HER2阴性乳腺癌相比，HER2阳性乳腺癌患者具有更差的预后及更高的病死率，但造成这一现象的具体分子机制尚未完全阐明［4-5］。近年来大量研究显示，趋化因子及其受体网络在乳腺癌的发生发展中具有重要作用，其中趋化因子CXCL12及其受体CXCR4与CXCR7受到研究者的广泛关注［6］。国内外大量研究报道，CXCL12、CXCR4和CXCR7在乳腺癌患者肿瘤组织中表达显著增加，进一步研究提示，较其他类型的乳腺癌亚型相比，CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白在HER2阳性乳腺癌中的表达异常增加，这可能与该类型乳腺癌较差的预后相关［7-8］。然而，关于趋化因子CXCL12及其受体CXCR4和CXCR7对HER2阳性乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等生物学行为尚无相关研究报道，因此，为进一步阐明CXCL12、CXCR4和CXCR7在HER2阳性乳腺癌发生发展中的作用，本实验通过体外培养HER2阳性乳腺癌细胞BT474，并采用siRNA转染技术单个及联合沉默CXCR4与CXCR7，探究CXCL12-CXCR4/CXCR7网络对乳腺癌细胞生物学行为的调控，以期为治疗HER2阳性乳腺癌提供有效的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人HRE2阳性乳腺癌细胞系BT474购自美国ATCC细胞库；RPMI1640、含EDTA的0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（美国Gibco公司）；胰岛素、CXCL12（美国Sigma公司）；CCK-8试剂（日本东仁科技公司）；TRIzol、逆转录试剂盒（美国Thermo公司）；SYBR Green Real-time PCR（上海索莱宝生物公司）；转染试剂脂质体Lipofectamine3000（美国Invitrogen公司）；沉默CXCR4、CXCR7的siRNA（即si-CXCR4、si-CXCR7，广州锐博生物科技公司）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；PI/RNase试剂、基质胶（美国BD Biosciences公司）；Transwell小室（8µm，美国Corning公司）；RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF（南京凯基生物）；兔抗CXCR4、CXCR7（美国Santa Cruz公司）；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin（美国Cell Signaling Technologies公司）；HRP标记的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物公司）；PRPCR引物由上海生工构建；Bio Tek ELx800酶标仪（美国Bio Tek公司）；BD FACS流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组

1.2.1.1 细胞培养BT474细胞培养于含15%0.1 U/ml胰岛素的RPMI1640培养液中，并置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%融合时用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.1.2 siRNA转染转染前常规消化细胞，调整密度至5×104个/ml，培养过夜后，更换培养液为Opti-MEM，并按Lipofectamine3000说明书转染，将si-CXCR4、si-CXCR7分别及联合转染至BT474细胞，并 记 为si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7细 胞。转染6 h后将培养基更换为原培养液，置于上述条件的细胞培养箱中培养。取转染12 h后的细胞进行后续相关实验。

1.2.1.3 细胞分组按实验目的将细胞分为5组，A组：正常培养 的BT474细 胞；B组：100 ng/ml CXCL12处理的BT474细胞；C组：100 ng/ml CXCL12处理的转染si-CXCR4细胞；D组：100 ng/ml CXCL12处理的转染si-CXCR7细胞；E组：100 ng/ml CXCL12处理的联合转染si-CXCR4与si-CXCR7细胞。上述各组细胞共同置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，如无特殊说明，培养48 h后进行后续相关实验。

1.2.2 CCK-8实验检测各组乳腺癌细胞的增殖活力取生长状态良好的BT474细胞，消化细胞后接种至96孔板，调整细胞密度为3×104个/孔，待细胞贴壁后，按1.2.1方法进行转染及处理，置于上述条件的培养箱中培养，并分别于12 h、24 h、36 h、48 h时向每孔细胞中加入10µl的CCK-8试剂，在培养箱中继续孵育3 h后，于酶标仪450 nm处检测每孔吸光度值（A450）。每个时间点每组设置5个复孔，绘制细胞生长曲线。实验单独重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测各组乳腺癌细胞的周期分布常规消化上述5组乳腺癌细胞，并于4℃、70%乙醇中固定过夜，收集细胞，调整密度至3×105个/ml，并加入0.5 ml的PI/RNase充分混匀，4℃避光孵育30 min。最后流式细胞仪检测细胞周期分布。实验单独重复3次。

1.2.4 划痕实验检测各组乳腺癌细胞的迁移能力将5组乳腺癌细胞按5×104个/孔接种至底部划有间隔为5 mm平行线的24孔板中，置于上述条件培养箱中培养，待细胞生长融合至80%时，垂直于底部的两条平行线去除线条内部细胞，PBS充分冲洗，继续培养48 h后显微镜下拍照观察，并计算分析。实验单独重复3次。

1.2.5 Transwell侵袭实验检测各组乳腺癌细胞的侵袭能力在Transwell小室底部包被BD基质胶，室温静置30 min后，将无血清培养基的5组乳腺癌细胞按3×105个/ml接种于小室中。配制Transwell下室溶液，A组下室为含15%FBS的正常培养基，B～E组为含100 ng/ml CXCL12与15%FBS的正常培养基。培养48 h后，取出小室，湿棉签擦拭小室上层未穿出细胞，无水乙醇固定后，0.1%的结晶紫染色，PBS冲洗后，倒置显微镜观察穿出细胞数，每组随机选取5个视野进行计数。实验单独重复3次。

1.2.6 RT-PCR检测siRNA转染后乳腺癌细胞中CXCR4和CXCR7的mRNA表达 水平TRIzol法 提取转染si-CXCR4、si-CXCR7和si-CXCR4+7乳腺癌细胞中的总RNA，测定RNA纯度与浓度后，逆转录试剂盒进行合成cDNA。RT-PCR根据SYBR Green Real-time PCR试剂说明书确定的反应时间与温度进行。CXCR4-F：5′-CTGACTATTCCCGACTTCATCTTTG-3′，CXCR4-R：5′-CAATGTAGTAAGGCAGCCAACAG-3′；CXCR7-F：5′-CATGCAACAGCAGCGACTGCATCG-3′；CXCR7-R：5′-CAGCGATAATGGAGAAGGGAACG-3′。β-actin-F：5′-ATCACCATTGGAATGAGCGCAG-3′；β-actin-R：5′-TTGAAGGTAGTTCGTGGATCAG-3′；以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法进行分析。实验单独重复3次。

1.2.7 Western blot检测各组乳腺癌细胞中CXCR4、CXCR7和EMT相关蛋白的表达水平取待测细胞，应用RIPA裂解液及PMSF于冰上提取细胞总蛋白，BSA定量后，取适量蛋白样品加入1/4体积的SDSPAGE上样缓冲液中加热变性。取约40µg变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE分离，随后电泳转移至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭后，加入抗CXCR4（1∶500）、CXCR7（1∶800）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）抗体，并置于4℃条件下孵育过夜。随后加入HRP标记的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，最后均匀滴加ECL发光液后于凝胶成像仪曝光拍照。Image J软件测定条带灰度值。实验单独重复3次。

1.3 统计学分析采用SPSS19.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析及绘图，符合正态分布的数据采用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）的LSD-t进行分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中CXCR4和CXCR7的mRNA与蛋白表达RT-PCR与Western blot结果显示，与BT474细胞相比，转染si-CXCR4的细胞中CXCR4 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），转染si-CXCR7的细胞中CXCR7 mRNA与蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），而联合转染si-CXCR4+7的细胞中CXCR4和CXCR7的mRNA和蛋白表达均降低（P＜0.01），见图1。

2.2 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞增殖能力的影响CCK-8增殖实验结果显示，与A组乳腺癌细胞相比，B组、C组和D组细胞的增殖活力均显著增强（P＜0.05或P＜0.01），其中以B组的增强趋势最为明显（P＜0.01），而E组细胞增殖活力明显减弱（P＜0.05）；与B组细胞相比，C组、D组及E组细胞的增殖活力均明显减弱（P＜0.05或P＜0.01），其中以E组细胞的减弱趋势最为显著（P＜0.01）；与C组或D组相比，E组细胞增殖活力明显减弱（P＜0.05），前两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图1 转染siRNA后各组细胞中CXCR4和CXCR7的mRNA与蛋白表达Fig.1 mRNA and protein expressions of CXCR4 and CXCR7 in cells transfected with siRNA in each group

2.3 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞周期进展的影响流式细胞术检测结果显示，与A组乳腺癌细胞相比，B组、C组和D组细胞处于G1期的细胞比例均明显降低（P＜0.05），S+G2期的细胞比例均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），其中以B组细胞S+G2期的细胞比例升高趋势最为明显（P＜0.01），而E组处于G1期的细胞比例明显升高（P＜0.05），S+G2期细胞比例明显降低（P＜0.05）；与B组相比，C组与D组S+G2期的细胞比例明显降低（P＜0.05），处于G1期的细胞比例无明显变化（P＞0.05），而E组处于G1期的细胞比例均明显升高（P＜0.05），S+G2期的细胞比例明显降低（P＜0.01）；与C组或D组相比，E组G1期的细胞比例明显升高（P＜0.05），S+G2期的细胞比例明显降低（P＜0.01），前两组的细胞周期分布无明显变化（P＞0.05），见图3。

2.4 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞迁移能力的影响划痕实验结果显示，与A组乳腺癌细胞相比，B组、C组和D组细胞的迁移能力均明显增强（P＜0.05或P＜0.01），其中以B组细胞的迁移能力增强最为明显（P＜0.01），而E组细胞迁移能力明显降低（P＜0.05）；与B组细胞相比，C组、D组、E组细胞的迁移能力均明显减弱（P＜0.05或P＜0.01），且以E组细胞的减弱趋势最为明显（P＜0.01）；与C组或D组相比，E组细胞的迁移能明显减弱（P＜0.05），而前两组间细胞迁移能力差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

2.5 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞侵袭能力的影响Transwell侵袭实验结果显示，与A组乳腺癌细胞相比，B组、C组和D组细胞的侵袭能力均显著增强（P＜0.05或P＜0.01），其中以B组细胞的侵袭能力增强最为显著（P＜0.01），而E组细胞的侵袭能力明显减弱（P＜0.05）；与B组细胞相比，C组、D组、E组细胞的迁移能力均明显降低（P＜0.05或P＜0.01），且以E组细胞降低最为显著（P＜0.01）；与C组或D组相比，E组细胞的侵袭能明显减弱（P＜0.05），而前两组间细胞侵袭能力差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图2 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12对乳腺癌细胞增殖的促进作用Fig.2 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited proliferation promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

图3 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12对乳腺癌细胞周期进展的促进作用Fig.3 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited promotion of CXCL12 on breast cancer cell cycle progression

图4 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12对乳腺癌细胞迁移能力的促进作用Fig.4 Silencing of CXCR4 and/or CXCR7 inhibited migration promoting effect of CXCL12 on breast cancer cells

2.6 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞EMT能力的影响Western blot结果显示，与A组乳腺癌细胞相比，B组、C组和D组细胞中E-cadherin表 达 水 平 均 显 著 降 低（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），而E组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水均无明显变化（P＞0.05）；与B组细胞相比，C组和E组中E-cadherin表达水平显著升高（P＜0.01或P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低（P＜0.01或P＜0.05），且以E组上述蛋白的变化趋势最为明显（P＜0.01），但D组细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平均无明显变化（P＞0.05）；与C组相比，E-cadherin表达水平在D组中明显减少（P＜0.05），而在E组中明显增加（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平在D组中明显增加（P＜0.05），而在E组中明显减少（P＜0.05），见图6。

图5 沉默CXCR4和（或）CXCR7抑制CXCL12对乳腺癌细胞侵袭能力的促进作用Fig.5 Silencing CXCR4 and/or CXCR7 inhibited invasion ability promotion effect of CXCL12 on of breast cancer cells

图6 沉默CXCR4和（或）CXCR7对CXCL12诱导的乳腺癌细胞EMT能力的影响Fig.6 Effect of silencing CXCR4 and/or CXCR7 on EMT ability of CXCL12-induced breast cancer cells

3 讨论

目前，临床针对HER2阳性乳腺癌的主要治疗手段为手术、放疗、化疗等，其中针对分子表型进行的靶向化疗已成为临床治疗的一种重要方式。迄今为止，以抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗为首的靶向化疗药物方案是HER2阳性乳腺癌患者的重要治疗策略，然而，临床观察发现，经曲妥珠单抗治疗治疗一段时间后，约50%的患者会产生药物不敏感，即耐药现象［9-10］。因此，亟待寻求新的潜在靶点以提供更为有效的治疗方法。

趋化因子属于小分子蛋白类的细胞因子超家族，能够与G蛋白偶联受体相互作用，进而诱导细胞骨架的重排、黏附及定向迁移等行为。研究显示，趋化因子CXCL12高表达于淋巴结、肝脏、肺等多种组织与器官中，且能够趋化表达其受体的乳腺癌细胞优先转移至上述器官［11-12］。此外，CXCL12在乳腺癌细胞中的高表达与肿瘤的侵袭、转移及不良预后均有关［13］。CXCR4是最早发现的CXCL12受体，其为G蛋白偶联受体，能够通过不同的G蛋白亚基激活多条下游信号通路，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、EMT等生物学功能［14］。研究表明，CXCR4在乳腺癌组织中持续表达，且CXCL12对表达CXCR4阳性的乳腺癌细胞具有较强的趋化作用，能够诱导肿瘤的特异性迁移，故CXCR4与原发性乳腺癌的转移密切相关［12，15］。CXCR7是CXCL12新发现的另一个受体，研究显示，CXCR7主要表达于原发肿瘤组织的血管系统，推测其可能通过促进肿瘤细胞对纤维蛋白和内皮细胞的黏附，从而促进肿瘤的发展及转移［16］。同时，数据表明高表达CXCR7能够增强乳腺癌细胞的黏附、侵袭和血管生成能力，在体内可促进肿瘤生长［17］。

本研究结果显示，通过siRNA感染技术单独沉默HER2阳性乳腺癌细胞BT474中的CXCR4与CXCR7均可显著抑制CXCL12对乳腺癌增殖、细胞周期进展、迁移及侵袭能力的促进作用，说明CXCR4与CXCR7在肿瘤的增殖、迁移及侵袭能力上发挥对等的促进作用，而联合沉默CXCR4、CXCR7表达能最大程度地抑制CXCL12对肿瘤细胞上述恶性行为的促进。这与CXCR12-CXCR4/CXCR7网络对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭等行为的调控具有一致性［18］。但在EMT的检测实验中发现，单独或联合沉默CXCR4后，CXCL12对乳腺癌细胞EMT的诱导能力被极大削弱，而单独沉默CXCR7对CXCL12 EMT诱导能力的减弱作用没有沉默CXCR4明显，提示在BT474细胞中，CXCL12可能主要通过与受体CXCR4相互作用促进乳腺癌的EMT行为。结合研究CXCL12-CXCR4/CXCR7网络对其他肿瘤细胞EMT调控的相关报道发现，CXCR4与CXCR7对CXCL12的这一作用的相应功能并非完全一致，其中CXCR7介导肿瘤细胞EMT的过程可能具有严格的环境特异性与细胞类型特异性。如在卵巢癌中，CXCL12诱导的EMT现象能够被CXCR4抑制剂所拮抗，而不能被CXCR7抗体抑制［19］。同样在胰腺癌中，CXCL12主要与CXCR4结合，通过非经典Hedgehog途径促进肿瘤细胞的EMT［20］；但在肺癌中主要为CXCR7参与TGF-β诱导的EMT行为［21］。上述结果表明，CXCL12-CXCR4/7对HER2阳性乳腺癌细胞增殖、细胞周期进展、迁移和EMT行为的调控具有一定的差异性。

综上，研究发现沉默CXCR4或CXCR7表达均可抑制CXCL12对HER2阳性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期进展的促进功能，但CXCL12主要通过与CXCR4相互作用来促进乳腺癌的EMT行为，而同时抑制CXCR4或CXCR7能更有效地抑制CXCL12的上述功能。本实验进一步揭示了CXCL12及其受体CXCR4与CXCR7在HER2乳腺癌中的具体作用，为HER2乳腺癌的治疗提供了潜在作用靶点，但其具体机制仍有待进一步研究。