人参皂苷衍生物AD-1对CD4+T细胞亚群的调控及对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠的影响①

薄 琳 李芳芳 陈一方 李佳威 金桂花 金权鑫 赵余庆 黄学洙 金 丹

（延边大学医学院免疫学与病原生物学教研室，延吉 133002）

机体受病原体侵袭后，T细胞被其受体和抗原提呈细胞信号激活后可分化为具有不同特征的亚群发挥功能［1］。根据识别抗原不同分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞可分化为Th1、Th2、Th17细胞、Treg及其他细胞，在机体中发挥不同调控作用。机体产生炎症通常伴随体内CD4+T细胞亚群失调，且已有研究证实患炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）后也会产生这种情况，可目前其治疗药物一般具有副作用大、致使病情反复等缺点，而中医药治疗已成为新的靶点，因此，寻求可调控T细胞分化的中药及衍生替代物对IBD治疗具有重要意义。

现代医学研究已证实人参在心血管、内分泌等多个系统中发挥功效，尤其是在免疫系统中起调控作用。皂苷类产物在抗炎方面更是功效显著。RB2在肺损伤小鼠治疗中展示出了一定免疫调节作用［2］；Rg1也已被证实可减轻脂多糖诱导的细胞凋亡和炎症［3］。AD-1是人参浆果提纯得到的皂苷衍生物，已被证实对肝癌细胞A549、H292具有比其他皂苷类更明显的抑制作用［4］。但AD-1对机体免疫细胞的调节作用鲜有报道。因此，本研究旨在探究AD-1是否可调控CD4+T细胞亚群分化及其对小鼠实验性结肠炎的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6～8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠购自延边大学实验动物中心，每日保持各12 h的明暗光照循环，23～25℃、50%～70%相对湿度饲养，自由进食饮水。

1.1.2 主要试剂与仪器AD-1由沈阳药科大学赵余庆教授赠予。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）购于美国MP biomedicals公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购于中国天津科密欧公司；APCIL-17抗 体、PerCP-Cy5.5-IL-4和APC-CD69抗 体 购于美国BioLegend公司；PE-CD25抗体、APC-CD4和FITC-CD4抗体及破核剂购于美国eBioscience公司；PerCP-Cy5.5-IFN-γ和FITC-Foxp3抗 体 购 于 美 国Invitrogen公司；抗鼠CD3ε和CD28抗体、抗鼠IFN-γ和IL-4抗体、人重组TGF-β1和鼠重组IL-2、鼠重组IL-6、鼠重组IL-12p70、鼠重组IL-23购于美国Pepro-Tech公司；刀豆蛋白A（con A）购于Sigma公司；RPMI1640培养基和胎牛血清购于以色列BI公司；佛波酯/离子霉素混合物（PMA/Ionnmycin）、布雷非德菌素A/莫能霉素混合物（BFA/Monensin）及破膜剂（GAS003）购于中国联科生物公司；分选幼稚CD4+T细胞的试剂和缓冲液购于德国美天旎公司；流式细胞仪（FACSVerse）购于美国BD；CO2恒温孵育箱购于日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 幼稚CD4+T细胞分离实验采用预冷溶液并全程在冰上进行。乙醚麻醉小鼠，脱颈法处死后剥离脾脏和肠系膜淋巴结，置于含10 ml RPMI1640培养基的平皿中进行研磨制备悬液，过筛滤去包膜组织，加入1 ml红细胞裂解液处理1 min，加入5 ml PBS终止反应，离心后重悬、计数，将细胞终浓度调整至1×108个/ml。按每107个细胞加入10µl抗体混合物（含CD8a、CD11c、CD25等）的比例4℃避光处理5 min，再按每107个细胞加入20µl上述生物素抗体混合物的磁珠和含CD44的磁珠与一定量缓冲液充分结合，同环境处理10 min，少量缓冲液润柱后将细胞悬液缓缓注入柱中，收集流出液体，洗涤2次即得到纯化的幼稚CD4+T细胞。

1.2.2 CD4+T细胞体外活化和分化分选出的幼稚CD4+T细胞以1.5×106个/孔接种于提前12 h包被了抗鼠CD3ε抗体（5µg/ml）的12孔板，加入抗鼠CD28抗体（3µg/ml）37℃、5%CO2孵育3 d。体外实验分组设置为幼稚CD4+T细胞组、活化的Control组，其余各组加入抗体的同时给予不同浓度（5、10、20µmol/L）药物为AD-1给药组。CD4+T细胞分化实验中，根据定向分化的不同亚群分别加入对应细胞因子及抗体37℃、5%CO2孵育5 d。同时设置Control组、AD-1给药组（5、10、20µmol/L）。细胞向Th1方向诱导分化时加入重组鼠IL-2（2 ng/ml）、重组鼠IL-12 p70（5 ng/ml），加入抗鼠IL-4抗体（5µg/ml）避免向Th2细胞分化；细胞向Th2方向诱导分化时，加入重组鼠IL-2（2µg/ml）、重组鼠IL-4（10µg/ml）和con A（5µg/ml）；细胞向Th17方向诱导分化时加入重组鼠IL-6（20 ng/ml）、重组鼠IL-23（5 ng/ml）、重组人TGF-β1（1 ng/ml），加入抗鼠IFN-γ抗体（5µg/ml）和抗鼠IL-4抗体（5 mg/ml）避免向其他方向分化；细胞向Treg方向诱导分化时加入重组人TGF-β1（5 ng/ml）。

1.2.3 实验性结肠炎小鼠模型构建将小鼠随机分为Control组、模型组、AD-1组，每组10只。模型组和AD-1组饮用3%DSS 5 d、水14 d，持续2个循环，再次饮用3%DSS 5 d结束造模，Control组全程饮水。AD-1组灌胃给予10 mg/kg AD-1（0.5%CMC-Na溶解），Control组和模型组灌胃给予相同浓度CMC-Na。

1.2.4 疾病活动指数（DAI）评分对小鼠进行DAI监测，包括体质量减轻程度、粪便性状及便血情况。体质量无减轻为0分，体质量下降1%～5%为1分，体质量下降5%～10%为2分，体质量下降10%～15%为3分；大便正常为0分，大便松软但成形为1分，大便非常松散为2分，腹泻为3分；无出血为0分，粪便潜血为1分，粪便带血为2分，便血为3分。造模结束分数总和相加，分析DAI评分。

1.2.5 HE染色造模结束后分离结肠组织，PBS冲洗无粪便后甲醛浸泡，石蜡包埋制作切片，脱蜡水化后经苏木素和伊红染色，封片观察肠道黏膜层情况。

1.2.6 流式细胞术收集细胞及制备组织单细胞悬液，洗涤2次，各样本管避光加入2.5µl CD69-APC抗体4℃染色40 min，洗涤，加入250µl固定液重悬，上机检测。Th细胞：收集细胞洗涤后，4µl/管加入稀释后的PMA、BFA混合物37℃培养5 h，1次/h摇晃，洗涤，1.25µl/管避光加入FITC-CD4抗体4℃染色40 min，破膜剂处理15 min。每管加入1.25µl APC-IL-17抗体、1.25µl PerCP-Cy5.5-IFN-γ和1.25µl PE-IL-4抗体4°C避光染色40 min，清洗，固定液重悬，上机处理。Treg：收集细胞并洗涤2次，加入0.625µl APC-CD4和0.625µl PE-CD25抗体4℃避光染色40 min，破核剂处理4 min，PBS清洗，加入0.625µl FITC-Foxp3抗体4℃避光染色40 min，清洗，固定液重悬，上机处理。

1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件作图并分析数据，数据以±s表示。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AD-1对体外培养CD4+T细胞活化的影响流式细胞术结果显示，Control组和AD-1组CD69活化指数与幼稚CD4+T细胞组相比提高（P＜0.01），且各组变化相对平稳，随着AD-1给药浓度变化并未发现细胞活化受影响（图1）。

2.2 AD-1对体外CD4+T细胞亚群分化的影响流式细胞术结果显示，与Control组相比，定向分化Th1细胞后，AD-1组明显抑制Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ表达（P＜0.01，图2A）；定向分化Th2细胞后，AD-1组明显促进Th2细胞分泌的细胞因子IL-4表达（P＜0.01，图2B）；定向分化Th17细胞后，AD-1组明显抑制Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A表达（P＜0.01，图2C）；定向分化Treg后，AD-1组明显促进Treg表面标志物CD25和转录因子Foxp3表达（P＜0.01，图2D）。

2.3 AD-1对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠的抗炎作用模型组及AD-1组小鼠在3%DSS干预的第4天体质量变化率达到峰值，模型组小鼠增长率始终低于Control组（P＜0.01，P＜0.05，图3A）；与模型组相比，随着给药天数增加，AD-1组小鼠体质量增长率逐渐上升（P＜0.01，P＜0.05，图3A）。与Control组相比，模型组DAI评分在前两个饮用DSS的阶段均显著提高（P＜0.01，P＜0.05），与模型组相比，AD-1组小鼠DAI评分下降（P＜0.01，P＜0.05，图3B）。模型组小鼠结肠相对变短，AD-1组小鼠结肠长度有所恢复（P＜0.01，P＜0.01，图3C、D）。HE染色结果显示，Control组小鼠结肠黏膜结构良好，杯状细胞结构完整，无炎症细胞浸润，模型组小鼠结肠黏膜受损，杯状细胞结构缺失，黏膜层伴随较多炎症细胞浸润，隐窝遭破坏，AD-1组小鼠结肠黏膜情况得到明显改善，杯状细胞恢复良好，炎症细胞浸润情况减轻（图3E）。

图1 AD-1对活化的CD4+T细胞CD69表达的影响Fig.1 Effect of AD-1 on expression of CD69 in activation of CD4+T cells

图2 AD-1对体外CD4+T细胞亚群分化的影响Fig.2 Effect of AD-1 on differentiation of CD4+T cells subsets in vitro

2.4 AD-1对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的调控流式细胞术检测DSS诱导的实验性结肠炎小鼠脾脏单细胞悬液发现，与Control组相比，模型组小鼠Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ和Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A表达显著增加（P＜0.01，P＜0.05，图4A、C），Th2细胞分泌的细胞因子IL-4和Treg表面标志物CD25和转录因子Foxp3表达显著降低（P＜0.05，图4B、D）。与模型组相比，AD-1组小鼠Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ和Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05，图4A、C），Th2细胞分泌的细胞因子IL-4和Treg表面标志物CD25和转录因子Foxp3表达显著增加（P＜0.05，图4B、D）。

图3 AD-1对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠的抗炎作用Fig.3 Anti-inflammatory effect of AD-1 on experimental colitis mice induced by DSS

图4 AD-1对DSS诱导的慢性IBD小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的调控Fig.4 AD-1 regulation of CD4+T cell subsets in spleen of experimental colitis mice induced by DSS

图5 AD-1对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠MLN中CD4+T细胞亚群的调控Fig.5 AD-1 regulation of CD4+T cells subsets in MLN of experimental colitis mice induced by DSS

2.5 AD-1对DSS诱导的实验性结肠炎小鼠MLN中CD4+T细胞亚群的调控流式细胞术检测DSS诱导的实验性结肠炎小鼠MLN制备的单细胞悬液发现，与Control组相比，模型组小鼠Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ和Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A表达显著增加（P＜0.01，图5A、C），Th2细胞分泌的细胞因子IL-4和Treg表面标志物CD25和转录因子Foxp3表达显著降低（P＜0.01，图5B、D）。与模型组相比，AD-1组小鼠Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ和Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A表达显著降低（P＜0.01，图5A、C），Th2细胞分泌的细胞因子IL-4和Treg表面标志物CD25和转录因子Foxp3表达显著增加（P＜0.01，P＜0.05，图5B、D）。

3 讨论

T细胞经双重信号刺激活化，第一信号通过CD3与T细胞受体结合生成复合体，使T细胞活化作用增强；第二信号通过CD28与抗原提呈细胞的配体结合，产生复合物活化T细胞。CD69是具有两个差异糖基化亚基（28～32 kD）的二硫键连接的同型二聚体蛋白，其表达在细胞被刺激后迅速出现于质膜表面，是其广泛作用于激活的淋巴细胞和自然杀伤细胞标志物的基础［5］。本研究将分选后的小鼠幼稚CD4+T细胞在体外使用抗体刺激活化3 d，流式细胞术检测细胞表面CD69表达，发现其阳性细胞数显著增多，证实细胞被活化，同时在不同浓度AD-1处理下，CD69表达无显著变化，提示AD-1未参与CD4+T细胞活化阶段。Th1细胞亚群的分化特点为转录因子T-bet表达及IFN-γ分泌［6］。信号传导转录因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）激活IL-12信号，促使细胞向Th1方向分化，主要参与细胞免疫，其产生的IFN-γ和肿瘤坏死因子α干扰细胞内寄生的病原体入侵并发挥免疫调控作用［7］。Th2细胞主要通过刺激B细胞参与体液免疫，分泌IL-4、IL-5和IL-13，其激活由STAT6信号驱动IL-4诱导GATA3表达［8-9］。转录因子GATA-3同时也调节Th2细胞分化。Th17细胞参与多种炎症和自身免疫性疾病发生和发展，主要分泌IL-17等［10］。IL-6通过STAT3诱导RORγt表达，从而促进促炎细胞因子IL-17和IL-22产生，募集粒细胞并在感染部位促发炎症［11］。稳定表达转录因子Foxp3的Treg通过抑制其他T细胞和调节其所处环境的免疫细胞抑制炎症反应［12］。本实验分选出小鼠幼稚CD4+T细胞后，活化同时加入不同刺激因子向不同方向分化细胞，同时给予不同浓度AD-1处理，结果显示，随着浓度改变，IFN-γ和IL-17A表达显著下调，抑制Th1和Th17细胞体外分化，同时上调IL-4和Foxp3表达，直接促进Th2细胞和Treg分化，提示AD-1对CD4+T细胞具有免疫调节作用。

过去IBD在欧美地区患病人数较多，近年由于生活方式和饮食习惯改变亚洲地区等发展中国家发病率也呈上升趋势。针对IBD的药物治疗均有明显弊端，如副作用大、效果不显著等，近年中草药应用日益增多，因其毒副作用小、具有多靶点的特点逐渐被重视。人参皂苷已被发现对炎症的治疗效果明显［13］。皂苷类产物Rd刺激大鼠内源性干细胞增殖，通过调节内源性肠道干细胞发挥药理作用改善大鼠IBD［14］。AD-1作为人参皂苷衍生物，被发现对肺癌细胞具有远超其他皂苷类产物的抗癌特性，但其对机体炎症的改善作用仍未见报道。为探究AD-1是否可治疗IBD、起抗炎作用，本研究建立DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型，经预实验结果选定造模期间AD-1为隔天给药方式，浓度为10 mg/kg，溶于0.5%CMC-Na更易于灌胃。随着给药天数增多，AD-1组小鼠体质量变化呈上升趋势，结肠长度缩短情况较模型组有所改善，DAI评分也逐渐降低，HE染色结果提示AD-1组小鼠黏膜层杯状细胞结构大部分恢复完整性，炎症细胞浸润减少，证实AD-1改善了DSS诱导的实验性小鼠结肠炎炎症反应。

HEGAZY等［15］发现IBD会导致IFN-γ和IL-17等促炎因子过量产生，Treg比例下调，致使CD4+T细胞发生紊乱。CD4+T细胞占据免疫调节的主导地位，一旦细胞因子网络失衡，可能会导致炎症细胞过度增殖或调节细胞功能下降，最终导致肠道损伤，加重炎症发生发展［16］。Th1/Th2细胞维持稳定占据免疫调控核心，二者状态一旦失衡可能会导致机体炎症反应，改善Th1/Th2紊乱状态被视为治疗免疫系统疾病的新思路［17］。小鼠哮喘模型中，槐杞黄有效逆转了Th1/Th2细胞失衡状态，抑制哮喘发展［18］。柴胡通过对大鼠乳腺炎症中细胞因子IFN-γ和IL-4紊乱的调节恢复两种细胞平衡，改善乳腺炎症程度［19］。Th17细胞和Treg分化和功能存在相关性。一旦打破这种平衡就会发生包括IBD在内的多种自身免疫性疾病。研究表明，与正常受试者相比，Th17细胞浸润了IBD患者肠黏膜，且效应细胞因子IL-17与正常受试者相比增加［20］。与Th17细胞相比，Treg不仅可抑制自身免疫性疾病发生，还可控制肠道炎症。实验性小鼠结肠炎模型中，外周血中Treg减少，并通过增加IL-10和TGF-β分泌明显改善小鼠腹泻症状［21-22］。这些因子可抑制肠道炎症级联反应并将其放大，从而改善肠炎临床症状。课题组前期实验已证实AD-1可在体外调控CD4+T细胞分化，因此本研究通过体内给药方式探究AD-1是否可改善实验性结肠炎小鼠紊乱的CD4+T细胞亚群，通过流式细胞术检测小鼠脾脏和MLN中CD4+T细胞相应细胞因子和转录因子，发现AD-1可明显改善实验性结肠炎小鼠体内CD4+T细胞紊乱，抑制Th1和Th17细胞的细胞因子IFN-γ和IL-17A分泌，下调转录因子T-bet和RORγt表达，促进Th2细胞和Treg细胞因子IL-4和IL-10分泌，上调转录因子GATA3和Foxp3表达，证实人参皂苷AD-1在体内可改善小鼠炎症程度同时对体内CD4+T细胞进行调控，具有一定免疫调节作用。

综上，AD-1在体外直接参与调控CD4+T细胞分化，对细胞直接进行免疫调控，初步证实AD-1通过调控CD4+T细胞亚群改善DSS诱导的小鼠实验性结肠炎，具体作用机制仍需进一步探讨。提示AD-1有望成为IBD的治疗药物，在治疗应用前景中具有独特发展空间，值得进一步开发。