表面活性剂对茫崖诺卡氏菌降解鄂尔多斯盆地富油煤过程的影响

申文盛，刘向荣，吴燕，赵顺省，杨再文，卢璇

(1.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054；2.自然资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室，陕西 西安 710021)

富油煤是一种特殊的煤炭资源，通过微生物降解能有效提取其高附加值产物，但降解率低限制了该技术在工业上的推广[1-7]。Fakoussa等学者先后报道了表面活性剂能促进煤的生物增溶程度，为提高煤的生物转化提供了一个新的思路[8-11]。

本研究利用茫崖诺卡氏菌降解鄂尔多斯盆地富油煤，探究了降解时间、菌液用量、加煤量、SDS、LAS、Tw-80和Triton X-100 4种表面活性剂和对茫崖诺卡氏菌降解富油煤的影响，对降解产物的组成进行红外光谱、气质联用色谱分析。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

煤样，采自鄂尔多斯盆地武家塔矿区，焦油产率9.9%，属富油煤；茫崖诺卡氏菌(N.mangyaensis)，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为：11046；甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯为色谱纯；蛋白胨、酵母粉、NaCl、硝酸等均为分析纯。

XMB-70A型棒磨机；SW-CJ-1FD型单人单面超净工作台；BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器；HZQ-F100型恒温振荡培养箱；TU-1900型紫外可见分光光度计；Agilent 7890A/5975 C型气相色谱-质谱联用仪；Spectumn GX型傅里叶变换红外光谱仪。

1.2 培养基

培养基组成以供货商提供配比制取：蛋白胨10 g， 酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

1.3 实验方法

1.3.1 煤样的预氧化处理 对煤样进行氧化预处理是促进煤微生物降解的有效方式[12]。将煤样粉碎、筛分，选取粒度100～150 mm。煤样和8 mol/L硝酸按照1∶2.5 g/mL的比例浸泡氧化24 h。去离子水冲洗至pH>5.6，抽滤、烘干备用。

1.3.2 微生物降解实验 茫崖诺卡氏菌以供货方所提供的培养方法进行活化，经3代培养后留存备用。在150 mL的锥形瓶中加入50 mL液体培养基、富油湈，锥形瓶用纸包好，用立式压力蒸汽灭菌锅灭菌。灭菌后接种复壮好的菌液，在恒温振荡培养箱中进行培养，设置温度30 ℃，振荡转速160 r/min。降解结束，煤样烘干(剩煤)。利用差减法计算煤的微生物降解率。

式中η——细菌溶煤率，%；

m1——起始加入的煤样质量，g；

m2——细菌作用后剩煤质量，g。

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1.4 分析方法

利用紫外分光光度计测定降解液450 nm吸光度(A450)，A450与降解效果正相关[13-15]。利用傅里叶变换红外光谱仪对原富油煤(原煤)、硝酸氧化富油煤(氧化煤)、剩煤进行红外光谱分析，采用KBr压片法，测试范围为4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。将表面活性剂作用下最优工艺得到的液相产物，使用不同极性的甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取。对萃取液的组成利用气相色谱-质谱联用仪进行分析。

2 结果与讨论

2.1 煤的氧预化

原煤和氧化煤的工业分析和元素分析见表1。

表1 煤样的工业分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of coal samples

由表1可知，富油煤经硝酸氧化处理后，灰分含量较原煤减少，可见硝酸预处理起到了脱灰作用；挥发分较原煤增加，可能是原煤中大分子结构被硝酸氧化断裂，氧化煤中易降解小分子化合物增多。另外，经硝酸处理的富油煤中氧含量明显增加，硫含量减少，可见氧化效果明显。

2.2 单因素实验

降解条件设置见表2。保持其它条件不变，考察降解时间、菌液用量和加煤量对煤样降解效果的影响,见图1。

表2 单因素实验Table 2 Single factor experiment

由图1(a)可知，降解时间<15 d时，对降解效果影响显著，>15 d时，影响较小，最佳降解时间为15 d。分析原因，微生物生长15 d后，可从培养基和煤样中摄取营养成分已耗尽，细菌不能生存。

由图1(b)可知，当菌液用量为160 mL/L时，茫崖诺卡氏菌对煤降解效果最佳。分析原因，细菌与煤样作用受传质作用影响，当煤样接触面达到饱和时，细菌数量的增加不能强化传质；此外，细菌增加到一数量，煤样中可降解物质已耗尽，对降解效果影响不显著。

由图1(c)可知，当加煤量为18 g/L时，降解效果最佳。原因可能是当培养基和细菌数量不变时，煤样的增加会加大菌种与煤样的可接触面积，降解效果显著增加。同时，当细菌可摄取营养源耗尽后，不能仅以煤为营养源生长繁殖，加煤量达到一定值后，降解效果不再增强。

2.3 正交实验

保持其它实验条件不变，取降解时间、菌液用量和加煤量3个因素，进行正交实验，水平见表3，实验结果见表4。

表3 因素水平表Table 3 Factor and level table

由表4可知，3个因素对实验的权重影响为C>A>B，即加煤量、降解时间、菌液用量对降解效果影响依次减弱。最佳工艺条件为A2B3C2，即降解时间为15 d，菌液用量为200 mL/L，加煤量分别为18 g/L， 此时降解效果最好，降解率为34.2%。

表4 实验结果Table 4 Test results

2.4 表面活性剂对降解影响

2.4.1 不同表面活性剂对茫崖诺卡氏菌生长的影响 实验不加煤样，灭菌前加入50 mL浓度为400 mg/L 的表面活性剂，通过观察茫崖诺卡氏菌菌液的A450和pH，研究表面活性剂对微生物生长的影响，结果见图2。

由图2可知，加入LAS、Tw-80和TritonX-100后，菌液始终保持在碱性环境下，有利于菌种的生长，茫崖诺卡氏菌接种后生长迅速,在对数生长期，茫崖诺卡氏菌以最快的速度生长繁殖，稳定期的细菌生长速度开始放缓。而加入SDS后，菌液显酸性，不利于菌种的生长。茫崖诺卡氏菌在培养的最初24 h内未观察到明显的生长，这表明茫崖诺卡氏菌很难适应SDS环境，SDS延缓了茫崖诺卡氏菌的生长，不利于茫崖诺卡氏菌快速繁殖。

2.4.2 表面活性剂对煤样微生物降解影响 在最佳工艺条件下，降解实验灭菌前加入50 mL LAS、Tw-80、Triton X-100的表面活性剂，测定经离心处理后的液相降解产物的pH、表面张力和A450，结果见图3～图5。

图3 4种表面活性剂浓度对降解液pH的影响Fig.3 Effects of concentrations of four surfactants on pH of degradation liquids

图4 4种表面活性剂浓度对降解液表面张力的影响Fig.4 Effects of concentrations of four surfactants onsurface tension of degradation liquids

图5 4种表面活性剂浓度对降解液A450的影响Fig.5 Effects of concentrations of four surfactants on A450 of degradation liquids

由图3～图5可知，随着加入表面活性剂SDS浓度的增大，降解液pH变小，不利于菌种生长，茫崖诺卡氏菌对氧化煤的降解效果越差；而随着加入表面活性剂LAS、Tw-80和Triton X-100浓度的增大，降解液始终保持碱性，液体表面张力变小，茫崖诺卡氏菌对氧化煤的降解效果先增强后减弱，最佳加入浓度分别为800，800，1 000 mg/L。其中Triton X-100增加效果最为明显，降解效果见表5，降解率为57.8%。

表5 Triton X-100作用下茫崖诺卡氏菌对煤样降解率的提高Table 5 Improvement of degradation rate of coal samples by N.Mangyaensisunder Triton X-100

实验结果表明，低浓度的表面活性剂可以促进煤炭的微生物降解，高浓度作用不明显。分析原因，多环芳烃是煤中大分子结构主要组成，随着其环数增加、疏水性增强，不利于菌种降解。低浓度的表面活性剂能改变煤炭的表面性质，增加煤炭的亲水性，有利于细菌及其分泌物与煤炭接触。在表面活性剂的胶束水溶液中，水相中煤样能够直接被微生物捕获而降解，见图6。

图6 表面活性剂胶束中煤样向微生物和酶传质过程Fig.6 Mass transfer of coal in surfactant micelles to microorganisms and enzymes

添加的表面活性剂形成稳定胶束，增溶的煤被运送到微生物细胞附近，微生物和煤的传质作用得到增强。这一机理与图4观察到的结果一致，低浓度的表面活性剂可以有效降低降解后液体的表面张力，表面活性剂的加入对茫崖诺卡氏菌降解氧化煤的效果明显。同时，表面活性剂浓度过高时，溶液渗透压会破坏细胞完整性，影响微生物的生长和代谢，降解效果降低[16]。

2.5 原煤、氧化煤和剩煤的红外光谱分析

图7为原煤、氧化煤和剩煤的红外光谱。

图7 原煤、氧化煤和剩煤的红外光谱图Fig.7 FTIR of raw coal,oxidized coal,biodegradation residual coal

2.6 富油煤降解液组成分析

分别用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯对降解液相产物进行萃取，总离子色谱依次见图8～图10。

图8 甲苯萃取物的GC-MS图Fig.8 GC-MS spectra of of toluene extract

图9 二氯甲烷萃取物的GC-MS图Fig.9 GC-MS spectra of of dichloromethan extract

图10 乙酸乙酯萃取物的GC-MS图Fig.10 GC-MS spectra of of ethyl acetate extract

由图8可知，甲苯萃取液含有40种化合物，分子量在92～493之间，其中烷烃类物质含量最高。

由图9可知，二氯甲烷萃取液含有27种化合物，分子量在134～647之间，其中烷烃类含量为63.65%，醇、酯类含量为16.45%，羧酸类含量为1.93%，胺类含量为3.01%。

由图10可知，乙酸乙酯萃取液含有3种化合物，分子量在278～338之间。

综上所述，茫崖诺卡氏菌对煤样的降解产物中主要含有烷烃类、酯类、醇类、羧酸类、胺类等小分子物质，降解液组成见表6，相对分子量在92～647之间。

表6 煤样的微生物降解液中有机化合物组成Table 6 Composition of organic compounds in microbial degradation solution of coal samples

3 结论

(1)在茫崖诺卡氏菌降解煤样过程中，加煤量对降解效果影响最大，降解时间次之菌液用量影响最小。最佳降解条件：降解时间为15 d，菌液浓度为200 mL/L，煤样浓度为18 g/L，此时降解效果最好，降解率为34.2%。

(2)表面活性剂LAS、Tw-80和Triton X-100随着浓度增加，降解效果先增大后降低，最佳加入浓度分别为800，800，1 000 mg/L，其中Triton X-100增加效果最为明显，降解率为57.8%，提高了23.6个百分点；SDS也增加煤炭表面的亲水性，但对菌种生长有抑制作用，不能促进菌种对煤样的降解。

(3)原煤、氧化煤和剩煤的红外光谱显示，微生物作用后，氧化煤的部分芳香环和羧基被降解，煤中的有机大分子已很大程度被茫崖诺卡氏菌降解成小分子。

(4)茫崖诺卡氏菌对氧化煤的降解产物中主要含有烷烃类、酯类、醇类、羧酸类、胺类等小分子物质，相对分子量在92～647之间。