牙龈卟啉单胞菌在阿尔兹海默症发生中作用的研究进展

王冠儒 冯强

山东大学齐鲁医学院口腔医学院·口腔医院微生态研究室 山东省口腔组织再生重点实验室山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室 济南 250012

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是痴呆病中最常见的类型，其具体表现为情景记忆和认知功能的进行性丧失，继而导致语言和视觉空间能力障碍，出现冷漠、攻击性和抑郁等[1]。对于AD的病理机制目前研究已经比较深入，主要有2个方面的因素，即Aβ淀粉样蛋白的沉积和tau蛋白结构的紊乱[2]，但是其病因仍然不明。既往的研究[3-4]显示，老龄、遗传因素、心脑血管疾病、糖尿病、肥胖、感染和口腔微生物群失调等都增加了AD的发病风险。其中，以牙周炎为代表的的口腔微生态是近年来被广泛认可的AD发病风险因素，其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingi-valis，P.gingivalis）是导致牙周炎微生物群失衡的关键菌[3]。

P.gingivalis为革兰阴性厌氧菌，是牙周炎主要致病菌之一。研究[5-6]表明，牙周炎是AD发病的风险因素，如人群回顾性队列研究显示，慢性牙周炎存在10年或更长时间会使AD的发病风险增加1.707倍[5]；牙周炎与AD等的痴呆指标的相关性分析显示，风险率的值为1.38（95%可信区间为1.01～1.90）[6]。

作为牙周炎的主要致病菌，越来越多的研究[7]显示，P.gingivalis与AD发生、发展存在密切的联系，如牙周P.gingivalis丰度与AD患者简易精神量表得分偏低密切相关。组织病理和免疫病理上的研究[8-9]显示，P.gingivalis在AD的发病中发挥着重要作用，AD患者的脑脊液中可检测到P.gingivalis的DNA且AD患者与对照组相比额叶灰质组之间的P.gingivalis丰度偏高；P.gingivalis的血清抗体检测显示，AD患者的IgG水平高于对照组[10-11]。上述研究说明，P.gingivalis可能是牙周炎促进AD发生的重要致病因素。

目前研究已经比较明确AD的病理特征，但具体的病因尚未明确。P.gingivalis可能是导致AD发病的一个危险因素，为病因研究提供了一个新的研究方向，本文对P.gingivalis在AD病因学方面的相关研究进行系统梳理，主要从P.gingivalis炎性介质分泌及宿主的免疫应答角度解析P.gingivalis促进AD发生的潜在致病机制，为深入开展AD的致病机制研究奠定基础。

1 P.gingivalis释放炎性介质的致病作用

1.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的致病作用

P.gingivalis释放的LPS根据分子结构的不同可以分为O-LPS和A-LPS，其中A-LPS又可分为四酰化的LPS1435/1449和五酰化的LPS1690。A-LPS可以根据外界环境的变化改变其结构，对TLR-4产生激动作用（LPS1690）或抑制作用（LPS1435/1449），影响宿主的免疫反应，从而有助于P.gingivalis适应局部炎症环境[12]。

P.gingivalis及其LPS是引起中枢和外周神经炎症的强大启动因素，能够导致脑组织发生神经炎和神经退行性变，是引发AD的重要危险因素。动物实验表明，连续5周系统地暴露于P.gingivalis-LPS可导致12月龄野生型小鼠脑中Aβ蛋白的聚集及学习和记忆障碍[13]。脑组织中的抗原提呈细胞如胶质细胞可以表达模式识别受体，如Toll样受体（Toll like receptor，TLR），识别病原微生物所表达的病原体相关分子模式，包括LPS、菌毛等，从而触发机体免疫系统释放大量促炎细胞因子[14]。P.gingivalis-LPS可 刺 激TLR-2/4和CD14，激 活TLR4/核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信号通路，包括TLR4/CD14受体、NF-κB和细胞因子，从而引起一系列的炎症反应[13,15]。此外，P.gingivalis-LPS通过其他多种方式引起和维持体内的炎症状态，其在AD发生中的作用值得深入研究。

1.2 牙龈蛋白酶的致病作用

牙龈蛋白酶是影响P.gingivalis免疫颠覆活性的重要毒力因子，主要由3个不同的基因（rgpA、rgpB和kgp）编码，前两者编码精氨酸特异性牙龈蛋白酶，后者编码赖氨酸特异性牙龈蛋白酶[16]。RGP和KGP可作用于蛋白酶激活受体2（protease activated receptor，PAR）2，随后激活的磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和丝裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）激酶/ERK通路有助于小胶质细胞向炎症区域迁移[17-18]。

牙龈蛋白酶可通过影响宿主免疫细胞的补体途径来逃避免疫监视，实现免疫颠覆，具体机制为牙龈蛋白酶可以裂解补体成分C1-C5，阻止C3b结合于细菌表面并捕获C4b结合蛋白，P.gingivalis通过与C4b结合蛋白的α链的补体控制蛋白（complement control protein，CCP）1结构域和CCP6-7结构域结合[19]，最终阻止膜攻击复合体的组装并获得调节C3转化酶的能力，导致脑组织内无法有效清除被感染的细胞，从而维持或加重AD[16]。

牙龈蛋白酶还可降解脑组织中的tau蛋白，tau蛋白的破碎在诱导不溶性及过度磷酸化的tau蛋白的形成中起关键作用[8]。脑内的炎症反应和tau蛋白的破碎使脑组织内tau蛋白结构紊乱，大量错误蛋白沉积，引起认知障碍和功能减退。动物研究[8]表明，牙龈蛋白酶的小分子抑制剂可以减轻小鼠的神经炎症并维持海马区神经元的活性；在犬类模型中，小分子牙龈蛋白酶抑制剂COR388可以穿透口腔生物膜，作用于牙龈蛋白酶靶点，降低口腔内KGP活性，进而改善AD相关的病理变化[20]。这些研究说明，牙龈蛋白酶可能在AD发生过程中具有重要作用，具体机制值得更深入开展研究。

1.3 肽基精氨酸脱亚胺酶（peptidyl arginine deiminase，PPAD）的致病作用

P.gingivalis能够分泌PPAD，促进蛋白质中的精氨酸残基转化成瓜氨酸，修饰自身和宿主蛋白[21]。研究[22]发现，AD患者的海马区PPAD含量增加同时有大量的瓜氨酸化蛋白积聚，瓜氨酸化的蛋白主要来源为脑组织的结构蛋白如波形蛋白、髓鞘碱性蛋白和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等[23-24]。

瓜氨酸化后的蛋白质会改变原来的三维结构，使其功能发生相应变化，导致宿主体内炎症信号网络失调。例如，GFAP是AD患者大脑中星形胶质细胞的标志物[24]，星形胶质细胞和神经元细胞的细胞骨架经过瓜氨酸化后具有毒性，一方面破坏细胞结构，导致细胞松解，血脑屏障被破坏，脑组织暴露于全身的炎症环境中，细菌及代谢产物可借此进入脑组织中引起神经细胞破坏[25]；另一方面，使与疾病有关的神经元释放其内容物到脑实质并进入全身的血液和淋巴循环，产生自身抗体破坏神经细胞，引起脑组织损伤[26]。由此可见，P.gingivalis导致神经细胞的破坏和脑组织的损伤可能是P.gingivalis促进AD发生的重要方式之一。

2 P.gingivalis干扰宿主细胞的免疫功能

2.1 逃避黏膜树突状细胞（dendritic cell，DC）的免疫监视

DC为抗原提呈细胞，是黏膜免疫的主要组成部分，可识别、吞噬和呈递相关抗原，引起机体的免疫应答，导致局部炎症反应。DC在清除口腔黏膜中的感染微生物和启动次级淋巴器官的获得性免疫反应中起着重要作用[27]。

不同于巨噬细胞及中性粒细胞，DC需要保留部分微生物抗原以呈递给免疫细胞，因此其内部存在抗原清除调节机制，若该机制失调，DC便会在宿主体内播散病原体[28]。将表达不同菌毛的P.gingivalis与人单核细胞来源的DC共同培养发现，表达Mfa1菌毛的P.gingivalis可以激活DC的特异性ICAM-3捕获非整合素受体，阻止细胞通过自噬小体和溶酶体途径清除病原体；表达FimA菌毛的P.gingivalis可以激活DC的TLR-2受体，促进DC破坏清除病原体，P.gingivalis通过调节Mfa1和FimA的表达来逃避自噬，从而在DC内存活[28]。该机制是P.gingivalis在体内长期存活，使得机体长期处于慢性炎症状态，导致脑组织中神经元相关蛋白代谢异常的基本前提，P.gingivalis借此方式在胞内寄生[29]，产生包含有LPS、牙龈蛋白酶以及荚膜、菌毛等毒力因子的微囊泡，持续向宿主细胞释放毒性产物，引起局部及全身的炎症反应[14]。

2.2 干扰小胶质细胞的正常功能

小胶质细胞是脑组织正常细胞，参与脑组织的免疫反应。当机体患有牙周炎时，炎症因子以及细菌成分通过影响小胶质细胞的经典途径和替代途径，引发神经炎症[30]。小胶质细胞可向炎症区域迁移并介导炎症反应，其引起的强烈的神经炎症可能参与AD的发生和发展。

P.gingivalis产生的牙龈蛋白酶可通过牙龈PAR2激活并诱导小胶质细胞的迁移和炎症反应[17]。动物实验[17]显示，在小鼠中P.gingivalis可通过PAR2激活小胶质细胞，随后激活的磷酸肌醇激酶/Akt和丝裂原激活的蛋白激酶/ERK激酶/ERK通路刺激小鼠小胶质细胞的细胞迁移和炎症反应。人小胶质细胞系HMC3细胞感染P.gingivalis实验[18]表明，P.gingivalis的炎症分泌物可以吸引小胶质细胞向炎症部位迁移，小胶质细胞强烈的炎症反应又促进了免疫系统的启动，导致严重的神经炎症，可能加剧AD患者的认知障碍和记忆丧失。

2.3 导致宿主细胞释放大量促炎细胞因子

P.gingivalis可加重AD的脑内炎症过程。P.gingivalis及其毒性产物水平的升高可通过经典和替代途径激活小胶质细胞，使其释放大量促炎细胞因子[30]。对慢性牙周炎患者和健康人的全血化验进行对比显示，10个差异表达的蛋白质中有5个与AD的病理相关，分别为：cofilin-2、磷酸丙糖异构酶、组织蛋白酶B、凝聚素和中间α-球蛋白抑制因子H4[31]；感染P.gingivalis的成年小鼠学习记忆能力受损，其脑组织中的促炎细胞因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β的表达水平升高[32]；P.gingivalis接种组小鼠脑内IL-1β和TNF-α水平均高于对照组[33]；在长期系统暴露于P.gingivalis-LPS的小鼠的神经炎症和神经功能障碍的启动中，组织蛋白酶B起关键作用[13]。

脑组织内的促炎细胞因子使神经细胞长期处于炎症状态，促进Aβ蛋白的合成并抑制其降解，导致脑内Aβ蛋白的蓄积[34]。促炎细胞因子还可引起神经细胞的破坏[35]，导致AD患者的认知功能下降。通过P.gingivalis感染的小鼠模型来研究丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB）的神经保护作用显示SalB可以降低脑内IL-1和IL-7的水平，提高脑源性神经营养因子的水平，通过抑制神经炎症来改善小鼠的认知障碍[36]。

P.gingivalis通过促进宿主细胞释放大量促炎细胞因子来间接作用于脑神经细胞，引起神经细胞的破坏。降低脑内促炎细胞因子的水平，提高神经营养因子的水平，可能会起到保护脑神经，改善AD患者的认知障碍的作用。

综上所述，牙周炎的主要致病菌P.gingivalis可能是AD发病的重要危险因素之一，P.gingivalis可通过多种机制促进AD的发生、发展和病情加重（图1）。

图1 P.gingivalis促进AD发生发展的潜在机制Fig 1 Potential mechanism of P.gingivalis promoting the occurrence and development of AD

首先，P.gingivalis具有很强的组织侵袭能力，可通过内吞作用进入细胞质并借由内质网进入自噬小体并阻止自噬小体向溶酶体转化，逃避宿主的免疫监视并延长其胞内生存期，在所侵袭组织中持续释放炎性介质[29]。同时，P.gingivalis可释放LPS[37]、牙龈蛋白酶[17]以及PPAD[21]等毒性因子，影响宿主的小胶质细胞[30]、黏膜DC[38]及免疫细胞的补体途径，导致免疫颠覆[16]，抑制宿主整体的免疫反应[39]，使宿主细胞释放大量促炎细胞因子，导致机体长期处于炎症状态，影响脑组织中相关蛋白（如tau蛋白）的合成与代谢，使患者脑组织中出现Aβ-42淀粉样蛋白沉积，引起认知障碍和记忆力减退。

患有AD的老年人随着病情的不断进展，其自我口腔保健能力不断下降，口腔健康状况尤其是牙周炎症程度不断恶化，又通过上述机制加重了认知障碍，形成恶性循环[40]。

正常情况下，大脑中基底膜覆盖的大脑毛细血管内皮细胞组成血脑屏障，专门用于防止病原体和免疫细胞到达大脑造成脑损伤，是先天免疫屏障[41]。P.gingivalis可通过牙周组织进入血液循坏造成菌血症[3]，其蛋白酶成分可以破坏毛细血管之间的细胞间质，导致体内炎症因子释放引起血脑屏障的通透性发生改变，使脑组织暴露于炎症环境中。P.gingivalis一方面通过直接影响构成血脑屏障的大脑毛细血管内皮细胞的晚期糖基化终产物受体而导致Aβ蛋白在脑内蓄积增加[42]，另一方面通过影响血脑屏障的低密度脂蛋白受体连接蛋白1使得Aβ蛋白的清除减少[43]，血脑屏障功能障碍导致淀粉样Aβ蛋白在脑组织内积聚，引起认知障碍。

值得关注的是，AD本身存在遗传易感性[44]，牙周炎及P.gingivalis与易感基因导致的认知功能障碍之间的关系仍未知。在P.gingivalis的致病机制方面，虽在免疫炎症机制和功能失调等方面取得部分研究成果，但是目前仍未阐明P.gingivalis导致AD发生的明确致病途径。亟待建立大人群的队列并进行跟踪随访研究，明确P.gingivalis在AD人群中的存在分布规律，分析口腔健康与AD发病风险因素的密切度及因果关系；开展P.gingivalis在AD发病中的作用机制研究，找出其致病的关键因子和致病方式；开展以P.gingivalis为靶向的AD诊断、干预、预防策略研究，从而为AD的治疗提供新靶点、新策略和新途径。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。