时钟基因在牙齿发育中表达分布与调控机制的研究进展

赵曼竹 宋锦璘

1.重庆医科大学附属口腔医院口腔综合科 重庆 401147；2.重庆医科大学附属口腔医院 重庆 401147

时间生物学（chronobiology）是研究机体生物节律及其应用的科学，也是一门新兴的生命科学领域的交叉性学科。生物节律作为生命活动的基本特征之一，存在于单核细胞、动物、植物，乃至人类的所有生命活动中，依照周期的长短可以分为短日节律（wltradian rhythm）、近日节律（又称昼夜节律，circadian rhythm）和长日节律（infradian rhythm）等，其中昼夜节律的研究最为普遍[1-2]。Science曾多次将这一领域评为“最有可能取得重大突破的领域”。2017年，Jeffreg Hall、Micheal Rosbash和Micheal Young因其在“昼夜节律调控分子机制发现”方面的奠基性贡献而获得诺贝尔生理学或医学奖[3]，足以证明昼夜节律的重要性和学者们的关注度。

昼夜节律是由一系列时钟基因周期性表达与相互作用实现的。近年来，时钟基因在口腔医学领域的研究取得了显著的进展，特别是在牙齿发育中有着重要影响[4]。牙齿硬组织发育开始于釉牙本质界髓角处，之后节律性地向颈部及面发育，即每天形成定量的一层基质，再矿化形成牙齿硬组织。这种周期性矿化留下了节律性痕迹，如釉质中的釉柱横纹、芮氏线等[5]，牙本质中的冯·埃布纳线[6]，牙骨质中的纤维牙板[7]。随着研究的不断深入，时钟基因在牙齿发育中的表达特点与调控作用被逐渐揭开面纱，本文对此作一综述。

1 时钟基因的反馈抑制理论

随着研究的不断深入，学者们发现时钟基因不仅表达于中枢系统，在外周组织也有表达。在哺乳动物中，昼夜节律的中枢振荡器存在于下丘脑视交叉上核区（suprachiasmatic nucleus，SCN），主要通过感受外界光线的明暗刺激，在调控中起主导作用。除中枢振荡器，外周组织中也存在着相似的生物钟振荡器，如肝脏、心脏、肌肉、白色脂肪组织等[1]。昼夜节律的调控需要中枢和外周振荡器同步协调，由一系列的转录翻译正负反馈通路组成。1990年提出的“反馈抑制理论”，用以解释周期蛋白含量振荡现象[8-9]。

反馈抑制理论示意图见图1：昼夜节律正向调节因子Bmal1（brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1）和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）在细胞核内形成异源二聚体，共同结合于其靶基因Per（Period）和Cry（cryptochrome）启动区的E-box（Ephrussibox）元件，激活转录信使RNA，进入细胞质不断翻译产生Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白等目的蛋白。当目的蛋白在细胞质中逐渐聚集达到一定浓度后，可被细胞质中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，随后穿梭至细胞核，与Bmal1/Clock二聚体竞争结合含有E-box序列的转录启动子，从而发挥负向作用，实现周期蛋白的24 h周而复始振荡，构成昼夜节律的分子生物学基础。除Per和Cry以外，Rev-Erb（reverse orientation c-erb）和Ror（RAR-related orphan receptor）也参与维持这个反馈通路的正常运行，即Bmal1/Clock二聚体通过结合Rev-Erb和Ror启动区的E-box元件，激活表达Rev-Erb和Ror蛋白，这些蛋白进入细胞核直接结合Bmal1、Clock的增强子Rore元件；但两个因子发挥的作用不同，Rev-Erb发挥抑制作用，Ror促进Bmal1、Clock基因的转录和表达。正是生物钟系统内各关键因子的协调作用，有序调节下游的时钟控制基因表达，才实现机身内复杂的生物节律活动[10-12]。

图1 核心时钟基因的反馈抑制理论示意图Fig 1 Schematic diagram for the feedback loop of core clock genes

2 时钟基因对干细胞增殖与分化的影响

2.1 胚胎干细胞

有研究[13-14]报道，时钟基因（如Bmal1、Per2等）在胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）内不呈现昼夜节律的表达特点；然而当ESCs被诱导分化后，则表现出昼夜节律的表达特点，所以学者们认为时钟因子可能参与ESCs分化的调控。另有研究[12]发现：Clock基因敲除后，ESCs呈现自然分化现象，推测Clock在多能干细胞向分化转化的信号通路中发挥重要调控作用。还有研究[15-16]发现，去分化逆转产生的诱导型干细胞（induced pluripotent stem cells，iPDCs），同样失去了昼夜节律特点，也表现为ESCs相似的增殖与多能干性，进一步证实了以上有关时钟基因参与ESCs分化调控的观点。干细胞增殖方面的研究显示：Bmal1通过Rev-Erba的响应元件RREs调控细胞周期检查点基因p12，从而调控细胞周期由静止期G1期进入DNA合成期S期[17]；此外，Per2也会通过其协同因子调控另一检查点基因p16，调控细胞周期由DNA合成后期G2期进入有丝分裂期M期[18]。基于目前的研究，学者们[12]认为：正因为ESCs没有昼夜节律的特点，增殖过程中不存在间歇期，从而表现出时钟基因对ESCs增殖的促进作用。

2.2 成体干细胞

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可表达时钟基因，且参与成骨分化调控。据报道[19]：骨髓来源的MSCs表达时钟因子Per1。另有研究[20-21]显示：从Bmal1全敲除和选择性敲除小鼠分离培养的MSCs成骨分化潜能受损；增龄引发的Bmal1表达下调，MSCs的体外增殖与成骨分化潜能均下降，提示时钟因子Bmal1具有正向调控MSCs的成骨潜能。Per1/Per2或Cry1/Cry2双敲除小鼠的骨沉积率和骨小梁量均有显著提升，提示时钟因子Per1/Per2或Cry1/Cry2可负向调控骨改建[22]。过表达Bmal1的成纤维细胞NIH3T3-E1可显著提升Runt相关转录因子（runt-related transcription factor，Runx）和骨钙素（osteocalcin，OCN）等的表达，进一步证实Bmal1具有正向调控成骨的作用[23]。在牙源性成体干细胞的研究中，Zheng等[24]报道：4种主要的时钟基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙囊组织中均有表达。还有研究[25]在牙髓干细胞中检测到Bmal1、Clock、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2时钟基因的表达，具有昼夜振荡特性，且受含羞草碱、棘球霉素和缺氧条件的影响。本课题组在前期体外实验[26-27]中也发现，大鼠外胚间充质干细胞表达Bmal1、Clock、Per1、Per2，除Clock外，其他3个因子同样表现出节律表达的特点。在牙源性干细胞与其他组织来源的干细胞的对比研究中，Bmal1、Per2、Rev-Erba在脂肪干细胞中的节律表达特点最明显，其次是骨髓间充质干细胞，而在牙髓干细胞中的节律表达不明显。可能的原因在于脂肪干细胞受外界光暗变化影响最大，其次是骨髓间充质干细胞，而牙髓干细胞被保护在牙齿硬组织中，所受影响最小[28]。

3 时钟基因在牙胚发育中的表达特点

对小鼠牙齿发育的动态追踪观察研究[24]显示：蕾状期（E14）和帽状期（E15）牙胚中均未见时钟基因表达，当牙胚进入钟状期（E17）时，时钟基因呈现高表达，所检测的4个时钟基因（Bmal1、Clock、Per1、Per2）中，Per1表达最强，Per2和Clock呈相似的表达分布特点，但Per2表达更强；时钟基因不仅在成釉细胞和成牙本质细胞中表达，在牙乳头和牙囊细胞中也有表达。

对出生后1 d的小鼠牙胚进行研究[29]发现：部分釉基质蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）如成釉蛋白（ameloblastin，Ambn）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）等呈现昼夜节律表达的特点，即夜间表达水平降低，但时钟节律经典基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙胚中的夜间表达却呈上升特点，并发现微小RNA可能参与调控牙胚发育过程中牙齿硬组织的周期性矿化。出生后4 d，Bmal1、Clock、Per1、Per2在成釉细胞和成牙本质细胞中均有表达，Bmal1在成牙本质细胞中的表达强于成釉细胞；Per2的表达分布特点与Clock相同，但Per2表达更强，两者不仅在成釉细胞和成牙本质细胞中表达，在牙槽骨中也可被检测到；Per1的表达相对较弱，但在牙槽骨中表达较强[24]。另有研究[4]报道，时钟因子Bmal1在出生后4 d小鼠牙胚的内釉上皮、中间层、星网状层以及成牙本质细胞层均有表达，而且另一时钟因子Cry1呈现同样的表达分布模式。出生后21 d，Per2在小鼠切牙的成牙本质和成釉细胞中强表达，冠切端表达极弱甚至不表达；在磨牙牙本质细胞、上皮剩余、牙槽骨的成骨细胞核中均有强表达，牙周膜中有表达，牙髓和牙骨质中不表达[24]。

4 时钟基因参与调控牙齿硬组织生成的机制研究

Ohtsuka和Shinoda[30]发现大鼠切牙短周期增量线出现在出生后7～10 d，昼夜增量线出现在12～15 d，从而认为SCN对牙齿硬组织的生长线有调控作用，而且SCN对昼夜光暗的反应和功能成熟大约在出生后2周左右。还有研究[31]报道：SCN损伤会导致鼠切牙釉质和牙本质增量线紊乱，初步证实昼夜节律参与牙齿硬组织生成的调控。也有相反的研究[32]发现：SCN单侧或双侧丧失功能后，短周期和昼夜增量线均未出现明显改变。通过生物信息学分析人、大鼠和小鼠的Amelx、Ambn、釉蛋白（enamelin，Enam）、基质金属肽酶（matrix metalloproteinase，Mmp20）基因上游区域中的E-box元件显示：在Amelx中，人和小鼠各有1个E-box，大鼠没有；Ambn中，人有3个E-box，大鼠有2个E-box，小鼠没有；而Enam只有人有1个E-box；Mmp20中3个种属均有多个E-box[4]。以上研究表明：SCN、Bmal1、Clock、Per1、Per2等时钟因子均参与硬组织增量线的生成调控，但牙齿硬组织的节律调控机制更为复杂，都不是缺一不可的，确切的分子机制仍需要进一步深入研究。

成釉细胞和成牙本质细胞是牙齿硬组织生成的最重要的功能细胞。研究[33]显示：Bmal1和Per2在成釉细胞中均呈周期性表达，但2个峰值出现的时间节点刚好相反。Per2在进入夜间前呈现峰值，进入夜间后开始下降，这一振荡特点与Amelx表达模式高度一致，进而发现釉基质内的溶酶体相关膜受体（lysosome-associated membrane protein，Lamp1）、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase，Car2）、碳酸氢钠协同转运子（solute carrier family 4 member 4，Slc4a4）3个因子与Per2呈相反的振荡规律，即夜间表达量显著增加[4,34]。这3个因子均与矿化密切相关，也印证了釉基质生成白天多、矿化沉淀夜间多的规律，同时也提示Bmal1可能促进矿化，Per2抑制矿化。另有研究[28,33]报道，成釉细胞中Per2、Bmal1、过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、Amelx均呈节律振荡表达，Per2敲除后成釉分化能力下降；进一步发现Per2通过信号轴PPARγ/AKT1/β-catenin（PPARγ/protein kinase B/beta-catenin）正向调控Amelx表达、釉基质分泌和矿化能力。这一结论在动物实验[33]中得到印证，即在无昼夜明暗变化环境下怀孕2周的小鼠牙胚中，Per2、Bmal1、Amelx、PPARγ、AKT1、βcatenin表达下降；继续观察出生后小鼠，发现切牙萌出速度下降，提示昼夜明暗变化促进成釉分化与硬组织生成。成牙本质细胞同样呈现昼夜节律的特点，白天分泌的胶原蛋白是夜间的2倍，而且也表达时钟基因，表达规律与成釉细胞存在差异[31]。本课题组前期研究[27-28]也发现：作为牙本质、牙骨质、牙槽骨和牙髓的生成细胞，神经嵴来源的外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells，EMSCs）节律性振荡表达per1、per2，且与低亲和力神经营养因子受体（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）密切相关，p75NTRExIII-/-敲除小鼠切牙的每日矿化量显著低于野生型和杂合子小鼠。另有研究[35]证实：p75NTR启动子上的E-box中的-1039位点可与Clock/Bmal1二聚体结合，影响生物节律基因Per1、Per2、Rev-Erba等的表达，参与昼夜节律调控。综上所述，在牙齿硬组织周期性矿化生成过程中，核心时钟转录因子不仅调控核心时钟基因的表达，也调控时钟控制基因（clockcontrolled genes，CCGs）的 表 达，如Amelx、Lamp1、p75NTR等，共同参与牙发育的昼夜节律调控（图2）[36]。

图2 时钟基因和时钟控制基因的信号调控通路示意图Fig 2 Schematic diagram for the signal pathways of clock genes and clock-controlled genes

5 小结与展望

目前，时钟基因在牙胚组织中表达已基本被证实，牙齿硬组织，特别是釉质和牙本质具有节律生成的特点。时钟基因在牙齿胚胎矿化初期（即钟状期）开始表达，参与多种成牙关键基因的表达调控（如Amelx、Ambn、Mmp20、Car2等）。然而，昼夜节律参与牙齿硬组织周期性矿化活动的调控机制研究还很少，时钟因子的调控作用与机制也相当复杂，确切的分子机制仍需要进一步深入研究。

时间生物学的出现将生命科学研究思维由静态转向了动态，昼夜节律分子机制的相关研究成果获得诺贝尔生理学或医学奖，也证明学者们普遍认同生物节律在生命科学中的重要性。相信随着研究的不断深入，时钟基因在牙齿发育中的调控作用与分子机制将被逐步揭示，启发学者用更多的视角解析牙齿发育理论，提出更科学的牙再生策略，早日实现再生人类的“第三副牙齿”。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。