经皮冠状动脉介入术后KLF5水平的变化及其在血运重建中的作用机制

曹培东 张海民

(高密市中医院介入科，山东省淮坊市 261500)

动脉粥样硬化是大中型动脉血管壁的多灶性改变，其特征是局部和/或全身炎症[1]、内皮功能障碍[2]及活动性脂质堆积[3]。动脉粥样硬化性冠状动脉狭窄可能导致心肌梗死和心力衰竭。经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)可提高心肌梗死患者的存活率，是临床治疗动脉粥样硬化性血管狭窄的主要方法[4]。尽管PCI技术在不断改进，但是PCI相关损伤导致的血管重构严重影响了血运重建的远期疗效。损伤后的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的过度增殖和炎症反应是动脉粥样硬化进展和PCI术后再狭窄的重要原因。Krüppel样因子(Krüppel-like factor，KLF)5是KLF家族的成员之一，在心血管重构的病理生理过程中发挥重要作用[5]。正常情况下KLF5在血管系统中的表达较低，但在损伤后的VSMC中明显升高，是应激反应与心血管重构的关键因素[6]。本研究探讨PCI对动脉粥样硬化性冠状动脉狭窄患者KLF5水平的影响，并采用生物信息学方法分析与动脉粥样硬化、血运重建相关的基因，运用染色质免疫共沉淀-高通量测序技术和实时荧光定量PCR验证上述相关基因与KLF5的关系，探讨KLF5影响血运重建的可能机制。

1 材料与方法

1.1 样本细胞和试剂

1.1.1 临床样本来源：收集2019年5～8月于广西医科大学第一附属医院心脏病研究所进行PCI治疗的14例动脉粥样硬化性冠状动脉狭窄(冠状动脉狭窄均≥90%)患者术前和术后的血液样本，患者均无心肌梗死、卒中、糖尿病史，均无特殊药物服用史，其中男性12例、女性2例，年龄43～72岁。

1.1.2 细胞和试剂：人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。KLF5(过表达)和KLF5-RNAi(沉默表达)慢病毒购买于上海吉凯基因。免疫共沉淀-测序的测序操作由生工生物工程有限公司完成。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、KLF5 ChIP抗体均购买于宝生物工程(大连)有限公司(批号：AJG2607A、AK71649A、AK81977A、2498900)。

1.2 检测血清KLF5水平 采集患者手术前后清晨空腹静脉血，室温条件下待血液自然凝固15 min后，2 500 r/min离心20 min，收集上清液保存待测。采用ELISA法检测患者血清KLF5水平，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(批号：ml204971)。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 筛选目的基因：从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取与动脉粥样硬化相关的GSE28829基因芯片数据集(该数据集资料包含13个早期和16个晚期颈动脉粥样硬化斑块样本)，再利用GEO2R在线分析工具分析芯片数据，选择校正后P<0.05且|log2FC|≥1的基因。另外，在开放访问网站pubmed2ensembl(http://pubmed2ensembl.ls.manchester.ac.uk/)中输入“revascularization”提取所有与血运重建相关的非重复基因。将动脉硬化相关基因和血运重建相关基因取交集，即为目的基因。

1.3.2 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络和筛选关键基因：使用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)评估筛选得到的目的基因的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)信息，将得分>0.4定义为具有显著意义[7]，并使用CytoScape 3.8.2软件构建PPI可视化网络[8]。利用分子复合物检测方法筛选重要模块基因，筛选条件为等级截止(degree cutoff)=2，k-core=2，节点分数截止(node score cutoff)=0.2，最大深度(max depth)=100。通过CytosHubba插件根据最大团簇中心性原则筛选关键基因，选择最短路径中的前6个基因进行富集分析。

1.3.3 富集分析：利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析，对涉及生物过程、细胞成分和分子功能的基因进行注释[9]，并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)信号通路富集分析[10]。

1.4 KLF5蛋白的染色质免疫共沉淀-高通量测序 使用甲醛把HCASMC细胞内的DNA与KLF5蛋白交联固定后裂解细胞。从细胞裂解液中分离出基因组DNA，通过超声处理将DNA随机打断为一定长度的小片段，添加KLF5蛋白特异性抗体(KLF5 ChIP抗体)，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与KLF5蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，然后富集这些DNA 片段，并对其进行纯化、文库构建及高通量测序(均由上海生工生物有限公司完成)。最后使用IGV 2.8.13软件对结果进行可视化处理。

1.5 实时荧光定量PCR 将KLF5和KLF5-RNAi慢病毒分别转染HCASMC 72 h后，利用RNAiso Plus提取总RNA。利用PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser进行反转录，然后利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ通过嵌合荧光法进行实时定量PCR。反应体系包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、cDNA模板2 μL、灭菌水6 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40个循环；融解曲线分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。内参基因β-actin及4个关键基因血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM1)、整合素β2(integrin beta 2, ITGB2)、C-X-C基序趋化因子受体4(CXC motif chemokine receptor 4,CXCR4)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9) 的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法分析各关键基因的mRNA相对表达水平，每个样本均设置3个复孔，实验均重复3次。

表1 引物序列

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行作图。采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动脉粥样硬化性冠状动脉狭窄患者PCI前后血清KLF5水平的比较 14例患者PCI前血清KLF5水平为(8.33±1.52)μg/L，术后血清KLF5水平为(4.64±1.34)μg/L，术后血清KLF5水平低于术前(t=8.913，P<0.001)。

2.2 目的基因 共获得217个与动脉粥样硬化相关的基因，以及581个与血运重建相关的基因。取二者交集后共获得23个重叠基因，即为目的基因，见图1。

图1 动脉粥样硬化和血运重建相关基因的韦恩图

2.3 关键基因与富集分析 通过STRING数据库及CytoScape 3.8.2软件构建PPI可视化网络，见图2。重要模块基因由13个节点和45条边组成，见图3。根据最大团簇中心性原则筛选出6个关键基因，包括MMP9、CXCR4、VCAM1、ITGB2、蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，PTPRC)和整合素αM(integrin αM，ITGAM)，见图4。对6个关键基因进行GO分析和KEGG分析，各保留排名前两位的分析结果，其中GO分析显示目的基因主要参与炎症反应、防御反应、急性炎症反应、白细胞迁移等生物过程(见表2)，KEGG分析显示目的基因主要通过白细胞跨内皮迁移信号通路发挥作用(见表3)。

图2 PPI可视化网络 图3 重要模块基因 图4 关键基因

表2 关键基因的GO功能富集分析结果

表3 关键基因的KEGG信号通路富集分析结果

2.4 IGV可视化结合位点 KLF5的染色质免疫共沉淀-高通量测序结果显示，ITGB2、MMP9、VCAM1和CXCR4均与KLF5存在结合位点，见图5。这说明白细胞跨内皮迁移信号通路中的4个关键基因均受到KLF5的调控。

图5 IGV软件对结合峰的可视化结果

2.5 KLF5可调控关键基因的mRNA表达 KLF5-RNAi组HCASMC中的ITGB2、MMP9和VCAM1的mRNA表达水平均低于KLF5组，而CXCR4的mRNA表达水平均高于KLF5组(均P<0.05) ，见表4。

表4 转染后两组HCASMC中关键基因相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

PCI是急性心肌梗死的重要治疗手段，与传统药物治疗相比，PCI能更有效地恢复心肌灌注，减小心肌缺血或梗死面积，改善患者的临床预后。然而，在PCI治疗过程中血管壁容易受到机械损伤而发生再狭窄，再狭窄常发生在动脉粥样硬化区，这极大地限制了冠状动脉血运重建的寿命和有效性[11-12]。PCI相关损伤诱导的血管重构是一种复杂的病理生理反应，包括VSMC的增殖和迁移、细胞外基质的形成和新生内膜的增生。为了预防PCI术后血管再狭窄，相关领域的学者们进行了一些探索。环孢素因对T淋巴细胞具有免疫抑制作用并对VSMC增殖具有抑制作用，被证明可以预防球囊导管损伤大鼠的动脉再狭窄[13]。随后，雷帕霉素被发现与环孢素有相似作用，临床上便以药物洗脱支架作为PCI后再狭窄的预防手段[14]。然而到目前为止，除了药物洗脱支架，解决PCI后再狭窄的方法有限，尤其是对于复发的支架再狭窄。

KLF5是多个细胞周期蛋白的调控因子，可激活细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E进而促进基因的转录和抑制细胞周期负调节因子p21的表达，进而促进VSMC增殖。KLF5也是调节VSMC表型的重要因子，其过表达可促进VSMC从收缩表型转变为增殖表型，从而促进动脉粥样硬化和血管再狭窄的发生[15-16]。研究表明，含有KLF5阳性细胞的人类冠状动脉标本比不含KLF5阳性细胞的人类冠状动脉标本具有更高的再狭窄风险[17]。本研究结果显示，14例动脉粥样硬化患者PCI后血清KLF5水平低于术前(P<0.05)。说明PCI后KLF5的降低可能与血运恢复后解除了冠状动脉缺血缺氧的状态有关。最新研究表明，缺氧会诱导肺动脉平滑肌细胞KLF5的表达[18]，并可通过缺氧诱导因子1α介导缺氧性肺动脉高压的血管重构[19]。这意味着PCI后的KLF5水平可能与血运恢复的程度呈负相关。

本研究的生物信息学分析结果表明，与动脉粥样硬化、血运重建相关的23个目的基因主要通过白细胞跨内皮迁移信号通路参与炎症反应、防御反应、急性炎症反应、白细胞迁移等免疫反应相关生物过程。白细胞通过静脉壁迁移是一种基本的免疫反应，启动了白细胞在静脉壁的极化运动，受刺激的血管内皮细胞将出现一过性的屏障破坏[20]。因此，不受控制的白细胞跨内皮迁移会加剧动脉粥样硬化的进展[21]。已有研究表明，降低KLF5表达可抑制动脉粥样硬化的炎症反应，减缓动脉粥样硬化的进展[22]。研究显示，VSMC特异性KLF5基因敲除显著降低了血管组织中炎症细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达[23]。本研究通过IGV软件分析发现，与血运重建相关的关键基因ITGB2、MMP9、VCAM1、CXCR4均受KLF5的直接调控；实时荧光PCR结果表明，降低KLF5可以抑制HCASMC中ITGB2、MMP9、VCAM1的表达，促进CXCR4的表达。已有研究表明，ITGB2、MMP9、VCAM1能够促进炎症反应，从而加重动脉粥样硬化[24-26]，而CXCR4则通过抑制炎症反应、保护内皮屏障功能、维持动脉完整性和VSMC收缩表型来限制动脉粥样硬化进展[27-28]。因此，PCI术后，随着KLF5的降低，受其调节的血运重建相关性基因均发挥了抑制动脉粥样硬化炎症反应的作用。

综上所述，KLF5的降低有利于抑制PCI后的血管异常重构，其可能通过调节白细胞跨内皮迁移通路的相关因子抑制动脉粥样硬化的炎症反应。PCI后血清KLF5水平或可反映血运恢复程度，因此KLF5可能是判断PCI预后的标志因子，并有望成为预防和治疗PCI后再狭窄的新靶点。