二氧化碳短期厌氧处理对双孢蘑菇采后生理及品质的影响

王佳莉，唐建新，英丽美，张云鹤，孙炳新

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

双孢蘑菇（）是世界上最常见的蘑菇品种，因其独特的营养价值、感官特性和药用价值而深受消费者喜爱。但是双孢蘑菇非常容易腐烂，在室温下的货架期仅为1～3 d，在冷藏条件下的货架期约1 周左右。如何保持双孢蘑菇的采后品质、延长其货架期是研究人员关注的一个热点。

短期厌氧处理是一种绿色安全的预处理技术，近年来越来越多地应用于果蔬的采后贮藏保鲜。Fallik等在对番茄的研究中发现，N短期厌氧处理24 h可显著减少由灰霉病菌导致的番茄果实腐烂，并且对番茄的可溶性固形物和酸度以及感官品质没有影响。Techavuthiporn等发现N短期厌氧处理可以保持西蓝花的外观，通过产生适量的乙醇来减少抗坏血酸的损失，且厌氧处理时间在18～24 h对抑制西兰花的黄化最为有效。Song Lili等发现N短期厌氧处理抑制了猕猴桃在低温贮藏期间的呼吸作用，减少了细胞膜电解质渗漏，通过增强抗氧化能力和维持膜完整性延缓了猕猴桃果实的软化，这与Bonghi等用高剂量CO（30%）短期厌氧处理桃果实所得实验结果类似。Techavuthiporn等在常温贮藏下利用N对菠萝果实进行厌氧处理16 h，结果发现短期厌氧处理后菠萝果实与对照相比，质量损失率降低，且厌氧处理抑制了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力，延缓了褐变的发生，颜色保持效果更好。Liu Hai和Liu Ting等研究发现N短期厌氧处理6 h能保持较高的能量水平，抑制了荔枝果皮褐变，延长了荔枝果实的货架期。以上研究发现说明短期厌氧处理对园艺产品采后贮藏保鲜是有效的，本课题组前期的研究也发现6 h短期厌氧处理（纯N）降低了双孢蘑菇的氧化损伤，延缓了蘑菇的衰老并保持了蘑菇的质地和风味。

CO具有抑菌防腐、减缓有氧呼吸以及影响乙烯生成等积极作用，是气调保鲜的常用气体。作为一种酸性气体，高水平CO可降低微生物体内的pH值，抽提细胞膜中磷脂及疏水化合物组分，从而引起好氧细菌及霉菌失活，减轻采后果蔬的腐烂；高水平CO还可以延迟浆果后熟衰老，避免低温冷害和其他生理性病害发生，能有效延长浆果货架期。同时，CO能够通过调节果蔬初级代谢及次级代谢，抑制果蔬采后色泽劣变，维持良好的质地结构，促进多种营养物质的积累，进而维持采后品质，提高果蔬贮藏性能。另外，外源CO处理可以提高植物细胞间隙CO的浓度，降低脱羧过程的速度，减缓呼吸进程，从而减少甚至抑制果实软化及霉烂的发生，提高果实的耐藏性和鲜食品质，延长贮运期。

综上，短期厌氧处理不仅能够减少果实的病害发生率，还能够抑制果蔬的呼吸速率，提高果蔬的贮藏品质，延长果蔬的货架期。尽管CO气体在抑菌防腐、延缓果蔬成熟衰老方面有着突出表现，但是在前期预实验中发现纯CO短期厌氧处理后的双孢蘑菇在货架期内褐变严重，但低水平的CO结合N进行短期厌氧处理是否能对双孢蘑菇的贮藏保鲜产生积极的影响还不清楚。因此，本研究拟在前期纯N厌氧处理的基础上，利用不同水平的CO（5%、10%、20%）对双孢蘑菇进行短期厌氧处理，探究短期厌氧处理条件下CO水平对双孢蘑菇采后生理及品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢蘑菇采自辽宁省凌源市兴旺食用菌专业合作社，挑选颜色洁白、菌盖直径（2.5±0.5）cm、形状均一、无机械损伤、未开伞的双孢蘑菇进行实验。

三氯乙酸 沈阳西陇化工有限公司；冰乙酸、碳酸氢钠、甲醇 国药集团化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸 上海瑞永生物科技有限公司；盐酸 天津市光复精细化工研究所；2,6-二氯靛酚 上海麦克林生化科技有限公司；偏磷酸 阿拉丁试剂（上海）有限公司；抗坏血酸 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T100气调包装机 德国Multivac公司；MIR-254-PC低温恒温培养箱 日本Panasionic公司；Checkmate3顶空气体分析仪 丹麦Dansensor公司；CM-2300d色差仪日本柯尼卡美能达公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；DDS-11A电导率仪 上海雷磁创益仪器仪表有限公司；HWS28型水浴锅 上海一恒科技有限公司；UV-1800型紫外分光光度计 日本岛津公司；CR21N高速低温离心机 日本Hitachi公司；H1650-W/H1650W台式微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；SA402B电子舌 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 双孢蘑菇前处理

双孢蘑菇在5 ℃下预冷4 h，称取110 g左右的双孢蘑菇置于BOPP托盒中（223 mm×133 mm×40 mm），使用聚酰胺/聚乙烯复合包装膜（薄膜厚度为69.2 μm、透氧率为7.90×10mL/（m·s·Pa）、透湿率为6.42×10g/（m·s））用气调包装机进行封装（热封温度为130 ℃、热封时间为2 s），封装后均立即放入（5.0±0.5）℃的低温恒温培养箱中进行贮藏。

共设4 个实验组，对照组充入纯N，记作N。3 个处理组分别充入5% CO+95% N、10% CO+90% N和20% CO+80% N的组合气体，样品依次记作5% CO、10% CO和20% CO。厌氧处理6 h后在包装盖膜中间打一个直径为0.3 mm的微孔。

1.3.2 顶空气体测定

使用顶空气体分析仪对包装盒内部的气体组成及相对含量进行测定，每组选取3 盒，每天测定一次。

1.3.3 呼吸速率测定

称取100 g双孢蘑菇，置于4.4 L密闭保鲜盒内于5 ℃放置1 h。使用顶空气体分析仪测定CO含量。呼吸强度表示为单位时间内单位质量的双孢蘑菇呼吸产生的CO质量。

1.3.4 质量损失率测定

测定每盒双孢蘑菇的初始质量并记为，贮藏第天的质量记为m（为3、6、9、12、15），质量损失率通过公式（1）计算。

1.3.5 色泽测定与外观分析

使用色差仪检测双孢蘑菇菌盖位置的色度变化，测定*、*、*值。其中，以*值代表蘑菇的亮度，*值越大，亮度越高；*值代表红色和绿色之间的变化，正值偏红，负值偏绿；*值代表黄色和蓝色之间的变化，正值偏黄，负值偏蓝。测定时，每个处理组随机选取5 个蘑菇并在菌盖随机取3 个点测定，取平均值，每3 d测定一次。褐变度（browning index，BI）代表双孢蘑菇的褐变程度，通过公式（2）、（3）计算。

蘑菇的外观检测是将双孢蘑菇置于Deep LED摄影棚内，使用相机分别对双孢蘑菇的菌盖和菌柄进行拍照，定期观察蘑菇外观的变化情况。

1.3.6 质构特性测定

参照秦苏怡的方法稍作修改，使用CT3质构仪对蘑菇的硬度和弹性进行测定。测定位置为菌盖中心，选择探头直径为0.4 cm，测试速率为1.5 mm/s，测量形变量为70%。

1.3.7 相对电导率和丙二醛含量测定

将蘑菇切片，用去离子水洗涤3 次除去表面附着的电解质，用滤纸吸干蘑菇样品表面的水分后，加入40 mL去离子水，摇床90 Hz振荡30 min，立即测定电导率（），然后将样品煮沸10 min并冷却至室温，测定电导率（），相对电导率计算如公式（4）所示。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）采用硫代巴比妥酸法测定，称取双孢蘑菇样品2 g，加入10 mL质量浓度100 g/L三氯乙酸溶液，研磨至匀浆，将研磨后的匀浆在4 000 r/min条件下离心10 min；取上清液2 mL（对照组加2 mL质量浓度100 g/L三氯乙酸溶液），再加入2 mL质量浓度6.7 g/L硫代巴比妥酸溶液，混匀后置于沸水浴中，15 min后，快速冷却降温摇匀后进行测定。分别在450、532、600 nm波长处测定上清液的吸光度。MDA含量计算如公式（5）所示，以鲜质量计。

式中：为MDA含量/（μmol/g）；、和分别为450、532 nm和600 nm波长处的吸光度。

1.3.8 抗坏血酸、总酚、类黄酮含量测定

通过2,6-二氯靛酚法测定抗坏血酸含量，称取5 g蘑菇样品，加入20 mL质量浓度30 g/L偏磷酸溶液，冰浴条件下匀浆，匀浆后冷冻离心30 min（4 ℃、7 000 r/min），收集上清液低温保存备用。取1 mL提取液，加入9 mL质量浓度0.1 g/L 2,6-二氯靛酚，待蓝色消失后在515 nm波长处测吸光度，以蒸馏水作对照。

参照Zhou Yahan等的方法，称取2 g蘑菇组织，加入少许经预冷的体积分数1%盐酸-甲醇溶液，在冰浴条件下研磨匀浆后，转入20 mL试管中，定容混匀，于4 ℃下避光提取20 min，期间摇动数次，然后过滤，收集滤液待用。以体积分数1%盐酸-甲醇溶液作空白调零，取滤液分别于280、325 nm波长处测定溶液的吸光度，重复3 次。以每克（鲜质量）蘑菇组织在280 nm波长处光密度值表征总酚相对含量，即OD/g，以325 nm波长处光密度值表征类黄酮相对含量，即OD/g。

1.3.9 味觉值测定

参照Dong Wenjiang等的方法稍作修改，采用InsentSA402B电子舌进行测定。称取5 g鲜样加入100 mL纯水充分匀浆，1 000 r/min离心10 min后取上清液上机测定，3 d测定一次。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS Statistics 26软件对数据进行方差分析，运用Duncan多重比较法对差异显著性进行比较分析（＜0.05），使用Origin 9.65软件绘图。

2 结果与分析

2.1 顶空气体分析结果

包装盒内O和CO相对含量变化如图1所示，包装内部环境一直处于超低氧（O相对含量低于1%）的状态，20% CO处理组的CO含量从第4天开始趋于平衡，N、5% CO处理组和10% CO处理组大概在第10天达到平衡。所有处理组的CO含量在到达平衡后约在21.8%～24.8%之间波动。气体环境是影响食用菌呼吸作用的重要因素，本课题组前期的研究发现当双孢蘑菇处于低O高CO环境中时，能够有效降低蘑菇的呼吸速率，延长其货架期。尽管各处理组初始CO的水平不同，顶空气体达到动态平衡的时间也不同，但是各处理组达到动态平衡后的O和CO浓度大致相同，这与蘑菇的呼吸速率以及微孔气调包装的透气性有着密切的关联。

图1 包装内部O2（A）和CO2（B）相对含量变化Fig. 1 Changes in O2 (A) and CO2 concentration (B) in packages

2.2 CO2水平对双孢蘑菇呼吸速率的影响

双孢蘑菇采后的呼吸速率如图2所示，第0天的呼吸速率为145.33 mg/（kg·h），4 个处理组均在第3天出现呼吸峰值，本课题组之前的研究发现，短期厌氧处理（纯N）在前3 d能够显著抑制蘑菇的呼吸速率。CO是有氧呼吸的主要产物，伴随着CO浓度的升高，会起到抑制呼吸的作用。在12 d前，CO处理组双孢蘑菇的呼吸速率显著低于N组（＜0.05），且对呼吸速率的抑制作用与CO含量呈剂量-效应关系，CO含量越高，抑制作用越明显；5% CO处理组和10% CO处理组在第9天的仍维持较高的呼吸速率，与第0天（145.33 mg/（kg·h））相差不大，分别为136.30 mg/（kg·h）和134.22 mg/（kg·h），20% CO组抑制呼吸作用程度最高，但呼吸强度太低可能导致蘑菇的能量代谢不足，导致贮藏效果反而不好。

图2 CO2水平对双孢蘑菇呼吸速率的影响Fig. 2 Effect of CO2 level on the respiration rate of Agaricus bisporus

2.3 CO2水平对双孢蘑菇质量损失率的影响

质量损失是影响双孢蘑菇采后品质的重要因素。双孢蘑菇的质量损失率如图3所示，质量损失率随着贮藏时间的延长而增大。其中20% CO处理组前3 d的质量损失率最小，可能与其呼吸速率最低有关，该条件下样品呼吸受到抑制，代谢速率减慢，质量损失率减小；从第9天开始，其质量损失率显著高于其他处理组（＜0.05），但其呼吸速率仍保持最低水平，并没有因为其保持最低的呼吸速率而维持最小的质量损失率，与上文推测的一样，低于双孢蘑菇最低的呼吸强度，贮藏效果反而不好；其他3 组在整个货架期的质量损失情况维持较好。

图3 CO2水平对双孢蘑菇质量损失率的影响Fig. 3 Effect of CO2 level on the mass loss of Agaricus bisporus

2.4 CO2水平对双孢蘑菇色泽和外观的影响

双孢蘑菇的亮度（*）和BI在贮藏期间的变化如图4所示。采后蘑菇菌盖的褐变是导致商品价值下降的主要原因。亮度与蘑菇品质密切相关，通常亮度更高的双孢蘑菇商品价值也更高。在贮藏期间蘑菇褐变的主要原因是由于酶促反应或微生物污染。从图4中可知BI与亮度呈相反的变化趋势，并且蘑菇的褐变程度随着时间的延长而增大。其中，5% CO处理组贮藏末期的*值保持最好（80.08），BI也最低（36.16），表明该条件处理蘑菇的贮藏保鲜效果最好。20% CO处理组的*值下降最快，褐变程度更高，表明长时间的高CO处理环境给双孢蘑菇的保鲜带来了不利影响。

图4 CO2水平对双孢蘑菇L*（A）和BI（B）的影响Fig. 4 Effect of CO2 level on the lightness (A) and browning index (B)of Agaricus bisporus

贮藏期双孢蘑菇的外观变化如图5所示，双孢蘑菇的菌盖的颜色变化与亮度和BI的结果一致。N组双孢蘑菇菌盖仅在贮藏末期出现褐变；5% CO处理组双孢蘑菇的菌盖和菌柄在整个货架期均未发生明显褐变；10% CO处理组双孢蘑菇从第9天开始从菌柄处出现褐变；20% CO处理组双孢蘑菇菌盖从第3天开始发黄，贮藏末期菌盖褐变严重。综合来看，5% CO处理组双孢蘑菇的保鲜效果最好，20% CO处理组双孢蘑菇保鲜效果最差。

图5 CO2水平对双孢蘑菇外观的影响Fig. 5 Effect of CO2 level on the appearance of Agaricus bisporus

2.5 CO2水平对双孢蘑菇质构特性的影响

双孢蘑菇的硬度和弹性变化如图6所示，所有处理组双孢蘑菇的硬度都高于初始硬度，这与Song Lili和Polenta等的报道一致。研究发现CO处理对酥梨、‘红地球’葡萄、轮南白杏、四川仔姜等的硬度维持有很好的效果。硬度和弹性的维持主要取决于细胞壁的机械强度和细胞的膨压，而机械强度和细胞的膨压与果蔬组织内大分子物质和水分含量密切相关。双孢蘑菇硬度和弹性的变化也与蘑菇的高水分含量有关。弹性是指果蔬在受到外力压缩后发生形变，在去除外力后所能恢复的程度，与果蔬新鲜程度有很大的关联，各处理组中5% CO处理组的弹性维持效果较好。

图6 CO2水平对双孢蘑菇硬度（A）和弹性（B）的影响Fig. 6 Effect of CO2 level on the firmness (A) and springiness (B) of Agaricus bisporus

2.6 CO2水平对双孢蘑菇相对电导率和MDA含量的影响

如图7所示，所有处理组的相对电导率随贮藏时间的延长逐渐增加，其中20% CO处理组从第9天开始显著高于其他组，原因可能是包装内部长时间高水平CO（＞20%）对蘑菇的组织结构造成了伤害，导致蘑菇的细胞膜损伤破裂，加速了相对电导率的升高。所有处理组在前9 d的MDA含量没有出现显著性差异，且与初始值相比变化不大；在12 d，10% CO处理组和20% CO处理组与5% CO处理组出现显著性差异（＜0.05）。贮藏期20% CO处理组MDA积累最多，膜脂过氧化最严重，相对电导率最高，电解质渗漏最严重，细胞膜透性最高，可能是长时间的高CO环境对双孢蘑菇产生了毒害作用，导致其细胞受损最严重，这也解释了其保鲜效果差的原因；5% CO处理组蘑菇的MDA积累最少，相对电导率最小，新鲜程度最好；N组蘑菇品质保存较好，仅次于5%CO处理组。结果表明长时间高水平的CO逆境胁迫对蘑菇的细胞的损伤是不可逆的，因此蘑菇在高水平的CO环境下贮藏不宜超过9 d。

图7 CO2水平对双孢蘑菇相对电导率（A）和MDA含量（B）的影响Fig. 7 Effect of CO2 level on the relative conductivity (A) and MDA content (B) of Agaricus bisporus

2.7 CO2水平对双孢蘑菇抗氧化物质含量的影响

抗坏血酸是双孢蘑菇体内重要的营养成分之一，然而该物质不稳定，易被氧化，是双孢蘑菇褐变的原因之一。如图8A所示，抗坏血酸含量在贮藏期间呈现快速下降趋势，其中N处理组和5% CO处理组双孢蘑菇的抗坏血酸含量下降相对缓慢，表明这两组蘑菇的抗氧化活性较高。20% CO和10% CO处理组的抗坏血酸含量在贮藏中后期下降明显。抗坏血酸能被氧化聚合生成有色物质，又与氨基酸、蛋白质等含氮化合物反应，加速褐变。因此，推测20% CO和10% CO处理组的褐变可能也与较低的抗坏血酸含量有关。

图8 CO2水平对双孢蘑菇抗坏血酸含量（A）、总酚（B）和类黄酮相对含量（C）的影响Fig. 8 Effect of CO2 level on the relative contents of ascorbic acid (A),total phenols (B) and flavonoids (C) in Agaricus bisporus

酚类化合物是蘑菇的主要天然抗氧化成分，能够终止在不饱和脂肪氧化过程中由自由基引发的连锁反应，减轻氧化损伤。如图8B所示，总酚相对含量在贮藏期先升高后下降，在Lin Qiong等也发现了类似的结果。20% CO处理组蘑菇在贮藏第6天总酚相对含量大量增加，可能是因为高水平CO造成的环境胁迫导致蘑菇自由基产生与清除系统失衡，从而需要更多的总酚来清除自由基以缓解环境胁迫导致的氧化损伤。黄酮类化合物在植物中起到抗氧化剂、抗菌剂等作用。如图8C所示，类黄酮相对含量在贮藏期也呈现出先升高后下降的趋势，可能是厌氧处理激活了查耳酮合酶，使类黄酮相对含量出现上升趋势，而后出现的下降趋势可能是其参与反应消耗了一部分，也可能是因为贮藏后期微生物发酵产生乳酸使pH值下降，抑制了类黄酮的生成。N处理组和5% CO处理组蘑菇总酚和类黄酮相对含量的上升和下降幅度不大，推测可能是环境胁迫压力较小及蘑菇氧化损伤较轻的缘故。

2.8 CO2水平对双孢蘑菇味觉值的影响

电子舌味觉值与人类感官评价之间存在显著相关性，因此可利用味觉值表征蘑菇的鲜味。本实验测定了双孢蘑菇的5 种风味物质，包括鲜味、甜味、苦味、咸味和酸味。如图9所示，所有组分的苦味和甜味随着贮藏时间的延长而下降；人体酸味阈值为-13，咸味阈值为-6，蘑菇的酸味味觉值变化范围为-47.67～-38.43，咸味味觉值变化范围为-12.85～-9.88，所有处理组蘑菇在整个贮藏期间酸味味觉值和咸味味觉值均低于其阈值，在此不作讨论。本实验主要关注蘑菇的鲜味变化情况，贮藏期所有组分蘑菇鲜味物质处于波动状态，在贮藏第3天升高，第6天下降，第9天又升高，蘑菇的初始鲜味味觉值为12.04，贮藏第12天，5% CO处理组和10% CO处理组鲜味物质保持较好，贮藏第15天，10% CO处理组仍保持10.61的鲜味味觉值。说明低水平的CO短期厌氧处理对保持双孢蘑菇鲜味具有效果。

图9 CO2水平对双孢蘑菇味觉值的影响Fig. 9 Effect of CO2 level on the taste value of Agaricus bisporus

3 结 论

不同水平的CO短期厌氧处理对双孢蘑菇的采后生理和品质有着重要的影响。低水平CO厌氧处理在降低双孢蘑菇的呼吸速率和质量损失率、抑制褐变、维持硬度和弹性、延缓细胞的氧化损伤和保持蘑菇鲜味等方面有着积极的效果。尤其以5% CO处理组保鲜效果最好，10%CO处理组次之，20% CO处理组保鲜效果最差。此外，尽管CO气体对双孢蘑菇呼吸作用的抑制效果明显，但是高水平的CO可能也加速了蘑菇细胞的氧化损伤。综上，CO气体在厌氧处理中扮演的重要角色，低水平的CO处理对双孢蘑菇的保鲜是积极有效的。然而，在选取高水平CO作为处理条件时需要谨慎。