牡蛎蛋白酶解物对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用

蔡雯雯，葛小东，李 娜，龚世禹，刘 斌，陈福泉，曾 峰,*

（1.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021）

牡蛎是一种常见的海洋无脊椎动物，盛产于我国沿海地区，如福建、广东、广西、海南、山东等。牡蛎在中国传统医药学中有着重要的地位，具有滋阴潜阳、镇静敛汗、固精止带、化痰软坚的功效，与其他中草药搭配熬制服用，可以治疗眩晕、自汗、盗汗等疾病，且效果显著。牡蛎肉与牡蛎壳均可入药，药用价值广泛，且牡蛎肉可食用，味道鲜美可口、营养丰富。此外，牡蛎提取物、酶解物及活性肽等活性成分还具有保肝、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂等多种生物活性。

肝脏在人体的新陈代谢中起着重要的作用。肝脏疾病主要是由病毒、过度饮酒和有毒化学物质等引起。反复损伤性炎症可导致肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至能使机体因肝衰竭而死亡。酒精性肝病中最严重的一种是酒精性肝炎，死亡率在20%～40%左右，多达75%的患者在确诊为严重酒精性肝炎后90 d内死亡。过量饮酒导致的酒精性肝病成为当今日益严重的公共卫生问题。全世界每年约有330万 人死于过度饮酒，约占总死亡人数的5.9%，过度饮酒可引起许多代谢性疾病。正常情况下，酒精通过胃和小肠吸收，然后通过血液进入肝脏。在肝脏中，乙醇通过乙醇脱氢酶被氧化成乙醛，乙醛经乙醛脱氢酶代谢成乙酸，经尿液排出体外。大量或长期饮用酒精饮料会使肝脏的解毒能力过载，导致酒精和乙醛的代谢物在血液和肝脏中积累，肝脏中过量的乙醛和乙醇的氧化代谢物会激活微粒体细胞色素P450系统，从而增加细胞色素P4502E1（CYP2E1）的活性，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。因此，氧化损伤被认为是饮酒的主要危害之一，也是慢性酒精性肝损伤（alcoholic liver disease，ALD）发病机制中的关键靶点。目前，针对牡蛎酶解物对慢性ALD的保护作用鲜有报道。

本实验构建ALD小鼠模型，通过不同剂量的牡蛎酶解物干预慢性ALD小鼠，探究牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠的血液和肝脏生化指标的影响，分析肝脏组织形态、关键基因mRNA转录水平上的变化，基于16S rRNA高通量测序技术研究牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠肠道菌群的影响，探究其保肝作用机制，以期为海洋生物资源的深加工及营养功能性食品的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级（SPF）雄性KM小鼠购自福州吴氏实验动物中心，生产许可证号：SCXK（京）2014-0004。

牡蛎 福州市金山大润发超市；中性蛋白酶北京索莱宝公司；RNA提取试剂盒、PrimeScipt反转录试剂盒、基因组去除试剂、荧光定量试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；Phusion Flash高保真聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）预混液、GeneJET凝胶回收试剂盒、Ion Plus片段文库试剂盒 美国赛默飞世尔科技有限公司；谷丙转氨酶（alaninetransaminase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

XPR105DR电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；SpectraMax iD3酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；SMZ18光学显微镜 北京普瑞赛司有限公司；A2481 PCR仪 上海智岩科学仪器有限公司；ABI7300荧光定量PCR仪、UltiMate 300分析型液相色谱-质谱仪 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蛎酶解物的制备

将牡蛎洗净，磨成肉糜状，分别用95%（体积分数，下同）乙醇溶液、55%乙醇溶液和水提取得到滤液I、滤液II和滤液III，经浓缩和冷冻干燥，分别得到牡蛎95%乙醇提取物（OY95）、牡蛎55%乙醇提取物（OY55）和牡蛎水提取物（OYWE）。取水提剩余物残渣，加入10 倍体积的去离子水，用1 400 U/g中性蛋白酶酶解（pH 7、4 h）得到滤液IV，经浓缩和冻干后得牡蛎酶解物（OYEH）。OY95、OY55、OYWE、OYEH的干质量得率按公式（1）计算。

1.3.2 牡蛎酶解物的多肽质谱分析

称取1 mg牡蛎酶解物，溶于1 mL 0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），将牡蛎酶解物溶液样品转移至对应的10 kDa超滤管中，于4 ℃离心（12 000×、10 min），上清液真空冷冻干燥。称取1 mg干燥样品重新溶于20 μL PBS，进行质谱分析。

人体胃肠道微生态受到出生方式、喂养习惯、饮食、药物、应激、地域、年龄等多种因素的影响[1]。胃肠道微生态参与机体的物质代谢、炎症信号通路转导、调控适应性免疫、维持肠道的完整性、保护机体免受致病菌损伤[2-4]。微生态的失衡与人体胃肠道疾病、糖尿病、肥胖、代谢综合征、自身免疫性疾病及肿瘤等相关，尤其是在人体胃肠道等多种疾病中触发了重要的病理进程。而胃肠道微生态与胰腺疾病的研究也引起了学者们的关注。

一级质谱分离的样品经离心干燥后，重新溶解于甲醇（色谱级）中进行液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析。将3 μL溶解后的样品上样到nanoViper C预柱（3 μm，100 Å），然后保持流速300 nL/min，冲洗脱盐5 min，采用Easy nLC 1000纳升液相色谱系统，样品脱盐后再经分析柱分离，分析柱是C反相色谱柱，流动相A为0.1%（体积分数，下同）甲酸-水，B为2%乙腈-水，洗脱条件：0～7 min，5%～20%A；7～9 min，20%～32% B；9～20 min，32%～55%A。采用PEAKS Studio 8.5软件进行数据加工处理和检索分析。

1.3.3 动物分组与慢性酒精性肝损伤实验

实验小鼠经过1 周适应性喂养期后，将其随机分为4 组，分别为正常组、模型组、牡蛎酶解物低剂量组（OYEL组）和牡蛎酶解物高剂量组（OYEH组），每组10 只。连续灌胃给予牡蛎酶解物4 周，每周记录小鼠体质量，每天上午9时牡蛎酶解物实验组小鼠分别灌胃给予0.25 mL高剂量（80 mg/（kg·d））和低剂量（40 mg/（kg·d））牡蛎酶解物（溶于无菌蒸馏水中），正常组、模型组灌胃给予等体积生理盐水。下午4时给予正常组小鼠灌胃5 mL/kg生理盐水，给予模型组、OYEL、OYEH组小鼠5 mL/kg体积分数50%乙醇溶液。末次灌胃后，各组小鼠隔夜禁食16 h后眼眶取血，颈椎脱臼处死小鼠。

1.3.4 血清与肝脏生化指标的测定

取小鼠肝脏称质量，按公式（2）计算肝脏指数。

用离心管收集小鼠血液，室温静置1 h后3 000×离心10 min，取上清液按试剂盒说明测定ALT、AST含量和TBA浓度。

将9 倍体积的生理盐水加入肝组织中，将肝组织在冰水浴中匀浆。将制备的匀浆在4 ℃条件下2 500×离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书测定肝脏TG、MDA、GSH含量。

1.3.5 肝组织形态学分析

取肝组织迅速置于质量分数4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋。经常规脱蜡、脱水后进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，通过40×显微镜拍照观察肝组织形态。

1.3.6 肝脏基因的mRNA转录水平分析

从肝组织中提取总RNA，并逆转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR（quantitative PCR， qPCR）测定、、mRNA转录水平。小鼠基因引物序列如表1所示。PCR条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变形25 s，60 ℃退火30 s，40 个循环。通过Rotor-gene Q软件进行数据分析，通过2法计算每个基因的相对转录水平。

表1 TLR4、NF-κB、TNF-α和β-actin的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplication of TLR4, NF-κB,TNF-α and β-actin

1.3.7 小鼠肠道内容物16S rRNA基因高通量测序

1.3.7.1 样品的预处理

分别取正常组、模型组、OYEL组、OYEH组各6 只小鼠的盲肠肠道内容物2 g，加入1×PBS，反复清洗，离心（3 000×、10 min）后获得沉淀物。

1.3.7.2 基因组DNA的提取

使用十六烷基三甲基溴化铵法对各组的DNA进行提取，引物对应区域为16S V3～V4区。

1.3.7.3 牡蛎酶解物对小鼠肠道菌群影响的分析

基于R语言，绘制影响酒精性肝损伤的生化指标与属水平上的肠道菌群的关联热图，使用Cytoscape 3.6.1软件绘制相关性网络图。

1.4 数据处理与分析

使用DPS 6.50数据处理软件和Excel软件对数据进行统计分析。使用单因素方差分析统计分析差异显著性，采用GraphPad 7.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 牡蛎不同极性提取物及酶解物的干质量得率

牡蛎4 种提取物的干质量得率如图1所示，牡蛎提取物的干质量得率依次为OY95（27.13%）＞OYEH（25.16%）＞OYWE（19.7%）＞OY55（9.29%）。牡蛎提取物的总得率为81.28%。

图1 牡蛎不同提取物的干质量得率Fig. 1 Dry mass yields of different extracts from oyster meat

2.2 牡蛎酶解物的多肽组成及序列

表2列出了牡蛎酶解物中主要多肽的序列。OYEH主要有20 个多肽序列。肽的丰度从高到低（前5）依次为GHPGLPGDAGPEGPRGNPG、IDLGAVN、EHPVL、GPAGPIGPR、MFLGPQ。丰度为前5的肽的一级质谱图和二级质谱图如图2所示。

表2 HPLC-MS鉴定OYEH的肽谱Table 2 Peptide profile of OYEH identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

图2 前5 种高丰度肽的一级质谱图与二级质谱图Fig. 2 Primary and secondary mass spectra of the first five highabundance peptides

2.3 牡蛎酶解物对小鼠体质量变化及状态的影响

从图3可以看出，在饲养第1周，各组间小鼠体质量差异不显著，2～4 周正常组的体质量显著高于其他组（＜0.05），在第2周后，OYEH组的体质量高于OYEL组与模型组。

通过4 周的动物实验，观察并记录了小鼠的外观、行为。结果发现正常组毛发光亮紧凑，行动灵活自如。模型组毛发暗淡无光、杂乱无章，且精神状态涣散，有嗜睡现象。OYEL与OYEH组的情况较模型组有所改善。

图3 牡蛎酶解物对小鼠体质量的影响Fig. 3 Effect of enzymatic hydrolysate from oyster on body mass of mice

2.4 牡蛎酶解物对小鼠血清生化指标的影响

肝组织胆固醇代谢的最终产物是TBA，通过测定小鼠血清TBA含量水平可间接反映肝脏受损伤的程度。如图4A、B所示，OYEH组的ALT、AST活力都显著低于模型组（＜0.05）。从图4C可以看出，模型组的TBA浓度极显著高于正常组（＜0.01），OYEL组与模型组相比没有显著差异，而OYEH组与模型组相比差异显著（＜0.05），表明OYEH显著降低ALD小鼠血清中TBA浓度。

图4 牡蛎酶解物对小鼠血清ALT（A）、AST（B）活力和TBA浓度（C）的影响Fig. 4 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on serum ALT (A) and AST (B) activity and TBA concentration (C) in mice

2.5 牡蛎酶解物对小鼠肝脏生化指标、肝组织形态的影响

从图5A可以看出，模型组的肝脏指数极显著高于正常组（＜0.01），OYEL与OYEH组的肝脏指数显著低于模型组（＜0.01、＜0.05）。从图5B可以看出，模型组的TG含量极显著高于正常组（＜0.01），OYEL与OYEH组的TG含量都显著低于模型组（＜0.05、＜0.01）。从图5C中可以看出，模型组的GSH含量极显著低于正常组（＜0.01），OYEL组和OYEH组的GSH含量极显著高于模型组（＜0.01）。从图5D可以看出，模型组的MDA含量显著高于正常组（＜0.05），OYEL与OYEH组的MDA含量显著低于模型组（＜0.05）。

图5 牡蛎酶解物对小鼠肝脏指数（A）和TG（B）、GSH（C）、MDA（D）含量的影响Fig. 5 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on liver index (A), and TG (B), GSH (C) and MDA (D) contents in mice

从图6A可以看出，正常组的肝细胞较完整，无细胞破裂、自溶或坏死的现象，分布均匀，肝细胞呈规则的球状。图6B中，肝小叶周围的细胞消融严重，且肝小叶中有溶血的情况，细胞分裂严重；细胞形状不规则，出现皱缩，大小不均一。肝细胞之间的边缘模糊，有脂肪空泡。由图6C、D可以看出，OYEL与OYEH干预后，相对于模型组，细胞的溶血情况有改善，其中OYEH组呈现出最接近正常组小鼠肝脏组织状态。

图6 牡蛎酶解物对ALD小鼠肝脏形态的影响Fig. 6 Effect of enzymatic hydrolysate from oyster on liver morphology in mice with chronic alcoholic liver injury

2.6 牡蛎酶解物对小鼠肝脏相关基因mRNA转录水平的影响

牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠肝脏中、和在mRNA转录水平上的影响如图7所示。与正常组相比，模型组小鼠肝脏、和mRNA的转录水平都显著升高（＜0.05）。与模型组相比，OYEL组与OYEH组3 个基因的转录水平都显著下调（＜0.05、＜0.01）。表明牡蛎酶解物能降低小鼠体内炎症因子的mRNA转录水平。

图7 牡蛎酶解物对小鼠肝脏TLR4（A）、NF-κB（B）和TNF-α（C）基因转录水平的影响Fig. 7 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on transcription levels of TLR4 (A), NF-κB (B) and TNF-α (C) genes in liver of mice

2.7 小鼠肠道菌群多样性及其与生化指标的关联性分析结果

2.7.1 小鼠肠道菌群物种相对丰度分析结果

用OYEH饮食干预小鼠4 周后，测定正常组、模型组、OYEL组和OYEH组小鼠肠道菌群的相对丰度，如图8所示，各实验组在门水平上的主要优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其余菌门相对丰度较低。与正常组相比，模型组的Firmicutes相对丰度极显著降低（＜0.01），Bacteroidetes的相对丰度极显著升高（＜0.01），模型组Firmicutes/Bacteroidetes的比值降低。与模型组相比，OYEL组与OYEH组中Firmicutes相对丰度显著升高（＜0.05），OYEH组中Bacteroidetes相对丰度极显著降低（＜0.01）。表明在门水平上，牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠肠道菌群的物种丰度影响显著。

图8 小鼠肠道菌群门水平上的物种相对丰度Fig. 8 Relative abundance of intestinal microflora at phylum level in mice

根据肠道菌群测序结果，选择正常组和牡蛎酶解物干预组属水平上丰度前3的物种，由图9可知，在属水平上的优势菌属主要有、和。与模型组比较，牡蛎酶解物干预组3 种菌属的相对丰度均呈上升趋势，推测这3 种菌属具有益生作用。

图9 小鼠肠道菌群属水平上的优势菌相对丰度Fig. 9 Relative abundance of dominant intestinal microflora at the genus level in mice

2.7.2 小鼠肠道菌群丰度与ALD生化指标水平的关联性分析结果

在属水平上选择丰度在前30的物种，基于Spearman相关检验指数分析，研究属水平下小鼠肠道菌群丰度与影响ALD生化指标水平之间的统计学相关性，如图10所示，在各组中富集的、丰度与肝脏指数、血清ALT活力和AST活力、MDA含量、TG含量、、和基因的转录水平呈正相关（＞0），与体质量呈负相关（＜0），丰度与AST活力、MDA含量呈负相关（＜0）。使用Spearman相关检验||＞0.35，绘制肠道菌群丰度与影响ALD生化指标之间的可视化网络图，如图11所示，、、基因转录水平、MDA含量与丰度呈正相关（＞0）。

图10 肠道菌群丰度与影响ALD生化指标水平之间的统计学Spearman相关性Fig. 10 Statistical Spearman’s correlations between intestinal microbiota abundance and parameter affecting alcoholic liver disease

图11 肠道菌群丰度与影响ALD生化指标之间的可视化网络图Fig. 11 Visual network between intestinal flora and parameters influencing chronic alcoholic liver injury

3 讨 论

牡蛎中含有丰富的生物活性物质，以牡蛎为原料，对其中活性成分依次进行提取和制备，通过动物实验研究牡蛎酶解物对ALD的保护作用，并结合肠道菌群分析其保肝的作用机制。肝脏是酒精代谢的主要器官，机体摄入的酒精过多会导致不同程度的肝损伤。ALD的发病机制与乙醇及其代谢物对肝脏的毒性、氧化应激、脂质过氧化、炎性细胞因子、免疫、机体稳态失调以及环境和个体因素有关。目前，常用血清中ALT、AST活力作为判断肝损伤程度的指标，在正常机体内，血清中ALT、AST含量不高，但当肝功能异常或者肝细胞结构破坏时，ALT、AST就会由破损处释放进入血液，导致血液中两者的含量升高，肝中含量降低。在本研究中，模型组的ALT、AST活力显著高于正常组（＜0.01、＜0.05），经牡蛎酶解物干预后，血液中的ALT、AST活力显著低于模型组（＜0.01、＜0.05），减轻了肝损伤程度。此外，体质量和脏器指数是反映机体健康与否的重要指标，酒精的摄入使小鼠体质量与肝脏指数发生变化。机体摄入过量酒精易造成脂肪酸代谢紊乱，积累大量TG，酒精到达肝组织后，能导致肝细胞膜上的脂质过氧化产物MDA含量升高，在本研究中，用OYEH干预可明显降低血清中TG和MDA含量，这表明OYEH可明显改善脂肪酸代谢紊乱和肝细胞脂肪变性。过量的酒精摄入使肝细胞中的抗氧化酶GSH活性降低，破坏机体氧化平衡，进而导致肝组织受损引起炎症反应，本研究中的肝脏组织形态分析结果表明，相较于模型组，OYEH的干预显著改善了肝细胞溶血情况，说明牡蛎酶解物能缓解小鼠酒精性肝损伤。Zhao Xiaoyan等通过给予青蒿素治疗严重ALD小鼠，其中模型组小鼠肝细胞中度坏死并出现炎性浸润现象，而青蒿素高剂量组小鼠肝细胞只有轻度坏死和炎性浸润，结果表明青蒿素可预防ALD。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、Toll样受体4（toll-like recepror 4，TLR4）、核转录因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是引起酒精性肝损伤的3 种重要炎症因子，酒精的摄入会诱导炎症因子的表达，在本研究中，与模型组比较，OYEL组与OYEH组的、、的mRNA转录水平均显著下调（＜0.05），进一步说明牡蛎对ALD有保护作用。

基于16S rRNA高通量测序技术研究牡蛎酶解物对ALD小鼠肠道菌群的影响。研究发现，在酒精作用下，Firmicutes丰度减少，变形菌门丰度增加，本研究中，与模型组对比，牡蛎酶解物干预使Firmicutes丰度增加。在属水平上，OYEH干预使、和的丰度增加。研究证实，能减轻小鼠结肠炎症状，本研究中牡蛎酶解物干预ALD小鼠后，丰度增加，推测具有益生作用进而发挥抗炎效应。摄入酒精导致的丰度降低，属于益生菌的一种，对维持肠道菌群稳态起着至关重要的作用。研究表明，酒精性肝病会使肠道菌群稳态发生变化，菌群稳态发生改变会激活某些通路，促进炎性因子如TLR4的产生。本研究中，丰度与、、基因的表达水平呈正相关，Wu Minna等研究表明丰度与甘露糖凝集素缺陷小鼠中的S24-7呈显著正相关，但是的具体功能仍不清楚，的丰度与体质量呈反比关系。Luo Xinming等研究狼疮小鼠的肠道菌群，发现丰度随着疾病的严重程度显著增加，推测与某些免疫疾病的发生有很大关系。此外，Miranda-Ribera等发现是促炎菌株，本研究结果也证实了这一点。Du Haiyang等研究黄连解毒汤对小鼠肠道菌群的影响，结果表明服黄连解毒汤能降低丰度，证实了属于有害菌。由此可知，牡蛎酶解物能够通过维持菌群结构的稳态，预防ALD引起的肠道菌群结构失衡。

综上所述，牡蛎酶解物能够抑制ALD小鼠肝脏内脂质过氧化，提高肝脏内抗氧化酶活力，减轻小鼠肝脏细胞的损伤程度，并可以提高小鼠益生肠道菌群丰度，表明其对ALD具有保护作用。