4种胶体金试纸条检测牛布鲁氏菌病的比较分析

董 浩 ， 李巧玲 ， 孙佳丽 ， 冯 宇 ， 蒋 卉 ， 沈青春 ，许冠龙 ， 朱良全 ， 秦玉明 ， 梁春南

(1.中国食品药品检定研究院 ， 北京 大兴 102600 ； 2.中国兽医药品监察所 ， 北京 大兴 102618)

胶体金免疫层析法已被作为一种布鲁氏菌病(简称“布病”)的初筛方法纳入我国卫生行业标准《布鲁氏菌病诊断》(WS 269—2019)，但是该方法尚未被收入我国动物布鲁氏菌病的诊断标准之中。在实际生产养殖、产地检疫等情况下，胶体金作为一种快速、敏感的现场检测方法，具有较高的应用价值。本试验分别对4种品牌的胶体金试纸条的敏感性、特异性、重复性进行了比较，并使用胶体金试纸条、虎红平板凝集试验、试管凝集试验和竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)对A19疫苗免疫的牛血清样品进行了检测，较全面地对4种品牌的胶体金试纸条的牛血清布病抗体检测性能进行评估，以期为畜间布鲁氏菌病的防控提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 血清样品 114份牛A19疫苗免疫血清采自陕西省某奶牛场，牛群免疫前已经过cELISA检测，全部为阴性。该牛群免疫前采集的本底血清为本试验中使用的布病阴性牛血清，用于牛布鲁氏菌病标准阳性血清的稀释，胶体金的特异性和重复性比较。牛布鲁氏菌病标准阳性血清由国家/世界动物卫生组织(OIE)动物布鲁氏菌病参考实验室提供。

1.2 试剂 布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌试管凝集试验抗原和布鲁氏菌病cELISA试剂盒，均购自中国兽医药品监察所；牛布鲁氏杆菌病抗体快速检测试剂盒，购自广州悦洋生物技术有限公司；布氏杆菌抗体快速检测卡，购自深圳市易瑞生物技术股份有限公司；布鲁氏菌抗体金标快速检测卡(竞争法)，购自浙江迪恩生物科技股份有限公司；牛羊布鲁氏菌抗体一步法胶体金快速检测卡，购自上海快灵生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 虎红平板凝集试验、试管凝集试验和cELISA按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)进行。4种胶体金试纸条按照商品说明书的相关要求对牛血清样品进行检测。

1.3.2 敏感性比较 使用布病阴性牛血清将牛布鲁氏菌病标准阳性血清依次稀释至40、20、10、5 IU和2.5 IU，分别使用4种胶体金试纸条和布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原对上述稀释的牛血清样品进行检测，每个稀释度的血清样品进行3次重复。

1.3.3 特异性比较 分别使用4种胶体金试纸条对A型口蹄疫疫苗免疫阳性血清、O型口蹄疫疫苗免疫阳性血清、牛沙门菌病疫苗免疫阳性血清和牛巴氏杆菌病疫苗免疫阳性血清进行检测，并比较它们的特异性。除此之外，还使用27份经过cELISA检测为布鲁氏菌病抗体阴性的牛血清样品对4种胶体金的特异性进行进一步评价。

1.3.4 重复性比较 分别使用4种胶体金试纸条对3份布病阴性牛血清和3份布病阳性牛血清进行5次重复检测，比较4种胶体金试纸条的重复性。

1.3.5 临床样品检测 分别使用4种胶体金试纸条、虎红平板凝集试验抗原、试管凝集试验抗原和布鲁氏菌病cELISA试剂盒对114份临床牛血清进行检测。

2 结果

2.1 不同种胶体金的初步比较 根据4种胶体金的产品说明书，对4种胶体金的检测原理、样品需求量、检测操作和判定时间进行了初步比较，结果如表1所示。

表1 4种胶体金的初步比较Table 1 Preliminary comparison of four colloidal gold strips

2.2 不同种胶体金试纸条敏感性的比较 使用4种胶体金试纸条和虎红平板凝集抗原分别对效价为40、20、10、5 IU和2.5 IU的牛血清样品进行检测，结果显示：A公司和B公司的胶体金进行3次检测全为阳性的最低效价均为2.5 IU；C公司和D公司的胶体金进行3次检测全为阳性的最低效价均为10 IU。4种胶体金试纸条的敏感性均高于虎红平板凝集试验。不同效价牛血清的3次检测结果如表2所示。

表2 4种胶体金试纸条和虎红平板凝集抗原的敏感性比较Table 2 Sensitivity comparison of four colloidal gold strips and rose bengal plate test

2.3 不同种胶体金试纸条特异性的比较 4种胶体金试纸条对A型口蹄疫疫苗免疫阳性血清、O型口蹄疫疫苗免疫阳性血清、牛沙门菌病疫苗免疫阳性血清、牛巴氏杆菌病疫苗免疫阳性血清样品均不发生交叉反应。采用4种胶体金试纸条对27份临床布病阴性牛血清进行检测，结果也全部为阴性，说明4种胶体金试纸条都具有良好的特异性。

2.4 不同种胶体金试纸条重复性的比较 4种胶体金试纸条在对3份已知布病阳性牛血清的5次检测中均为阳性，对3份已知布病阴性牛血清的5次检测中均为阴性。

2.5 不同种胶体金试纸条检测临床牛血清效果的比较 检测结果如表3所示，在4种胶体金试纸条中，A公司胶体金检出了97份阳性和17份阴性；B公司胶体金检出了96份阳性和18份阴性样品；C公司胶体金检出了99份阳性和15份阴性样品；D公司胶体金检出了88份阳性和26份阴性样品。

根据《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)，虎红平板凝集试验是应用最广泛的动物布鲁氏菌病初筛方法，试管凝集试验和cELISA可作为动物布鲁氏菌病血清学检测的确诊方法，因此本试验同时采用了虎红平板凝集试验、试管凝集试验和cELISA对上述牛A19疫苗免疫血清样品进行了检测，结果显示，虎红平板凝集试验检测出了85份阳性和29份阴性样品；试管凝集试验检测出了81份阳性和33份阴性样品；cELISA检测出了97份阳性和17份阴性样品。

为了进一步评价4种胶体金试纸条的效果，本试验分别计算了4种胶体金试纸条与cELISA结果的符合率。结果表明，A公司胶体金与cELISA的符合率为90.35%；B公司胶体金与cELISA的符合率为92.11%；C公司胶体金与cELISA的符合率为87.72%；D公司胶体金与cELISA的符合率为85.09%；虎红平板凝集试验与cELISA的符合率为86.84%；试管凝集试验与cELISA的符合率为84.21%(表4)。

表4 不同检测方法与cELISA的符合率Table 4 Coincidence rates of different methods with cELISA (%)

3 讨论

布鲁氏菌病是一种危害严重的人兽共患病，也是我国法定检疫和扑杀被感染家畜的3种重大动物疫病(口蹄疫、布鲁氏菌病和结核病)之一[1]。便捷、准确的检测方法是家畜布病防控的重要技术保障。目前，血清学检测方法是布病检测的主要方法，而病原学检测方法虽然是布病检测的“金标准”，因为存在操作复杂、实验周期长、生物安全风险较高、细菌分离率低等问题，应用非常有限。

现行的动物布鲁氏菌病检测国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)，布鲁氏菌病的血清学检测方法主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、乳环试验、间接ELISA、cELISA和补体结合试验等。虎红平板凝集试验因其操作简单、成本低廉等原因，广泛应用于基层兽医实验室的布病初筛。但是，虎红平板凝集试验作为一种初筛试验，它的敏感性偏低，该方法最低可以检测到22.5 IU的布病抗体。

胶体金免疫层析法是近几年来新兴起的一种检测方法，该方法操作简单，且在极短的时间内即可读取结果，十分适合动物疫病的现场检测。目前，已经有多篇文献报道了布病诊断用胶体金试纸条的研发[2-5]和布病胶体金试纸条与其他检测方法的检测效果比较[6-8]。

奚德华等[9]采用ELISA方法和胶体金方法分别对奶牛布鲁氏菌病进行了检测，其结果表明胶体金方法的敏感性、特异性和准确度均可以满足布病检测的需求，而且与ELISA 方法相比，胶体金方法不需要专业的实验条件，更适用于对奶牛养殖场现场的初筛。董浩等[10]采用胶体金试纸条和虎红平板凝集试验对658份牛血清样品进行检测时，胶体金试纸条比虎红平板凝集试验多检测出26份阳性样品。这些数据表明胶体金试纸条比常规的虎红平板凝集试验具有更高的敏感性，更利于检测到动物群体中的弱阳性个体，也更有利于阳性动物的早期诊断和尽早剔除。

和以往比较不同类型布鲁氏菌病检测方法的研究不同，本试验不仅将胶体金与不同检测方法之间的效果进行比较，还首次对4种不同品牌的胶体金试纸条检测牛血清样品的效果进行了比较，结果表明4种胶体金试纸条的敏感性、特异性和重复性都比较好。值得注意的是，由于本试验使用的临床样品主要是犊牛的A19疫苗免疫血清样品，而免疫动物的布病抗体滴度往往较低，部分血清样品的抗体滴度可能会接近胶体金和cELISA的最低检测限，这就会一定程度上影响胶体金和cELISA之间的符合率。在日常临床检测中，进行自然感染或者混合感染布病的牛血清检测时，理论上胶体金试纸条与cELISA的符合率会更高。可见，胶体金免疫层析法是一种比较可靠的牛布病血清学检测方法。因此，建议相关部门尽快将胶体金免疫层析法纳入动物布病诊断的相关标准中，以提高动物布病的检测能力，促进家畜布病的防控与净化。