丹参素通过JAK/STAT信号通路对冠心病大鼠的心肌保护作用及对血栓弹力图的影响

李 晨，薛 贤，韩 羽，陈现杰

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary heart disease，CHD)是临床最常见的心血管疾病，是由于冠状动脉粥样硬化，造成冠状动脉血管狭窄甚至阻塞、血栓形成加剧导致心肌缺血、缺氧、坏死而引发的一种心脏病。冠心病严重影响人类生命健康，是发病率和致死率较高的疾病之一。中药在治疗心血管疾病方面有着巨大的潜力和优势，丹参有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，其在冠心病心绞痛的治疗中被使用的频次最高[1]。从丹参水溶性部位分离到的丹参素有着广泛的药理活性，具有扩张冠状动脉、保护心肌、改善微循环、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗炎及增强免疫等作用[2-4]。丹参及其提取物在治疗心血管疾病方面有良好的效果，但在保护心肌、抗血栓方面报道较少。本研究通过建立冠心病大鼠模型，观察不同浓度丹参素对冠心病心肌损伤的影响，探讨丹参素对冠心病心肌损伤的保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠60只，7～8周龄，体质量250～300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产合格证号：SCXK(沪)2017-0005，购入后适应性饲养1周。

1.2 方法

1.2.1 建立冠心病大鼠模型 从60只大鼠中随机选取12只作为正常对照组，饲喂普通饲料。其余48只采用高脂饮食和注射垂体后叶素建立冠心病模型，每天饲喂高脂饲料，自由饮水，连续8周，末次喂养前72 h，按30 U/kg腹腔注射垂叶后体素，连续3 d，末次注射垂体后叶素24 h后，所有造模大鼠监测心电图，出现ST段移位或者T波高耸，提示造模成功，共45只(其中3只造模不成功)。45只造模成功大鼠随机分为4组，其中模型组11只，阳性对照组11只，丹参素低剂量组11只，丹参素高剂量组12只。

1.2.3 血栓弹力图(thromboelastography，TEG)检测 末次给药2 h后，腹主动脉采血，取0.9 mL全血加入0.1 mL柠檬酸钠抗凝并混匀。调节血栓弹力图仪主机预热至37 ℃，上杯，加血样，杯中悬针将血凝块应切力转变为电子信号，经电脑收集和TEG软件处理，得到TEG相关参数：R值、Aagle角、MA值。

1.2.4 心肌损伤指标检测 腹主动脉采血2 mL，静置后以2 500 r/min离心15 min，离心半径12 cm，分离血清。采用免疫化学发光法检测血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平。

1.2.5 氧化应激指标检测 腹主动脉采血2 mL，静置后以2 500 r/min离心15 min，离心半径为12 cm，分离血清。采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，化学比色法测定T-AOC。

1.2.6 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 采血结束后摘取心脏，取左心室冠状面中部的环状心肌组织块并置于10%的中性甲醛溶液中固定备用。取出固定于中性甲醛中约1 mm×1 mm×1 mm大小心肌组织，常规石蜡包埋、切片(心肌纤维纵切)，脱蜡，3%H2O2室温处理10 min；蒸馏水洗涤2 min；加入含有末端脱氧核糖核酸(TdT)和地高辛标记的脱氧尿嘧啶(DIG-dUTP)的缓冲液混匀，湿盒37 ℃反应2 h；10×封闭-洗涤缓冲液(TBS)封闭30 min；加入抗地高辛抗体，混匀湿盒反应30 min；TBS冲洗；用抗体稀释液，生物素-链霉亲合素-过氧化物酶法(SABC)混匀后反应30 s，TBS洗涤；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染30 s，脱水、封片。显微镜下观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色，每张切片随机选取5个不同视野，计算凋亡指数，即凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测心肌组织JAK2、STAT1和STAT3 mRNA表达量 采血结束后摘取心脏，取左心室前壁于液氮冻存备用。取液氮保存的心肌组织100 mg，提取总RNA，测定RNA纯度，反转录cDNA，进行基因片段扩增并定量。反应体系：模板cDNA 2 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，加双蒸水至总体积20 μL。反应条件：96 ℃预变性5 min，94 ℃变性5 s，65 ℃退火10 s，70 ℃延伸15 s，共45个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，以目的产物与GAPDH的比值表示mRNA的相对含量。引物序列见表1。

表1 基因及其引物序列

1.2.8 蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织JAK2、STAT1和STAT3蛋白表达量 取液氮保存心肌组织100 mg置于匀浆器中，加入细胞裂解液，匀浆后，离心取上清液，按照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明书检测蛋白浓度；取总蛋白50 μg十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳后转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；5%脱脂奶粉封闭2h，加入兔抗JAK2(1∶1000)、p-JAK2(1∶1000)、STAT1(1∶1000)、p-STAT1(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)，GAPDH(1∶4 000)，4 ℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温下孵育2 h，洗膜，增强型化学发光试剂(ECL)显色，暗室下曝光成像。通过Image J软件检测灰度值，进行结果分析。

2 结 果

2.1 各组TEG相关指标比较 各组TEG相关指标比较差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组比较，模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组R值均缩短，Angle角和MA值均增大，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组R值均延长，Angle角和MA值均减小，差异均有统计学意义(P<0.05)；与丹参素低剂量组比较，丹参素高剂量组、阳性对照组R值均延长，Angle角和MA值均减小，且丹参素高剂量组R值较阳性对照组延长，Angle角和MA值较阳性对照组减小，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组TEG相关指标比较(±s)

2.2 各组心肌损伤指标比较 各组血清CK-MB和cTnI水平比较差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组比较，模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组血清CK-MB和cTnI水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组血清CK-MB和cTnI水平均降低(P<0.05)；与丹参素低剂量组比较，丹参素高剂量组、阳性对照组血清CK-MB和cTnI水平均降低，且丹参素高剂量组CK-MB和cTnI水平低于阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组血清CK-MB和cTnI水平比较(±s)

2.3 各组氧化应激指标水平比较 各组血清SOD、MDA和T-AOC水平比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组比较，模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组血清SOD、T-AOC活性均降低，MDA含量均增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组血清SOD、T-AOC活性均升高，MDA含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与丹参素低剂量组比较，丹参素高剂量组、阳性对照组血清SOD、T-AOC活性均升高，MDA含量均降低，且丹参素高剂量组血清SOD、T-AOC活性较阳性对照组升高，MDA含量较阳性对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠血清SOD、T-AOC和MDA水平比较(±s)

2.4 各组心肌细胞凋亡情况比较 正常对照组、模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组心肌细胞凋亡指数分别为(3.36±0.34)%、(22.16±2.34)%、(15.48±1.72)%、(5.51±0.67)%、(9.64±1.19)%。各组心肌细胞凋亡指数比较，差异均有统计学意义(F=361.778，P<0.001)。与正常对照组比较，模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组心肌细胞凋亡指数均升高(P<0.001)；与模型组比较，丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组心肌细胞凋亡指数均降低(P<0.001)；与丹参素低剂量组比较，丹参素高剂量组、阳性对照组凋亡指数均降低(P<0.001)，且丹参素高剂量组心肌凋亡指数低于阳性对照组(P<0.001)。详见图1。

图1 各组心肌细胞凋亡情况(TUNEL×400)(A为正常对照组；B为模型组；C为丹参素低剂量组；D为丹参素高剂量组；E为阳性对照组)

2.5 各组心肌组织JAK2、STAT1和STAT3 mRNA相对表达量比较 各组心肌组织JAK2、STAT1和STAT3 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠心肌组织JAK2、STAT1、STAT3 mRNA相对表达量比较(±s)

2.6 各组心肌组织JAK2、STAT1和STAT3蛋白相对表达量比较 各组心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组比较，模型组、丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均升高(P<0.05)；与模型组比较，丹参素低剂量组、丹参素高剂量组、阳性对照组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均降低(P<0.05)；与丹参素低剂量组比较，丹参素高剂量组、阳性对照组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均降低，且丹参素高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3低于阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表6及图2。

表6 各组大鼠心肌组织JAK2、STAT1和STAT3蛋白相对表达量比较(±s)

图2 各组心肌组织JAK2、STAT1和STAT3蛋白相对表达量条带图(A为正常对照组；B为模型组；C为丹参素低剂量组；D为丹参素高剂量组；E为阳性对照组)

3 讨 论

冠心病发病率、致残致死率均较高，日益成为影响人类健康的主要疾病之一，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其主要发病原因。动脉粥样硬化斑块破裂继发血栓形成，引起冠状动脉狭窄闭塞，导致心肌缺血；在心肌缺血发展过程中，自由基大量产生，组织抗氧化能力下降，发生氧化应激，引起心肌组织过氧化损伤，最终导致心肌细胞凋亡或坏死[5]。随着中药制药技术不断发展，多种植物提取物在抗血栓、抑制氧化应激、抗细胞凋亡方面疗效明显，在许多疾病治疗中发挥着积极作用。丹参及其提取物制剂在临床上被广泛应用于治疗心血管疾病、肝肾病及皮肤病等，并取得了良好效果。

血栓形成与冠心病发生发展各个关键环节密切相关，凝血机制在血栓形成过程中起着重要作用。TEG是临床上广泛应用于监测凝血功能的重要检查方法，反映血液凝固动态变化指标。R值反映凝血时间，Angle角反映血栓形成速度，MA值反映血栓最大强度，是目前评价血栓风险较准确指标。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组R值缩短，Angle角和MA值增大，证实模型组大鼠血液处于相对高凝状态，存在明显凝血功能亢进，与冠心病发病机制相符；与模型组比较，丹参素各剂量组R值延长，Angle角和MA值减小，提示丹参素可改善TEG相关指标。研究表明，丹参素可以选择性抑制环氧合酶-2(COX-2)发挥抗血栓形成和抗血小板聚集作用[6-7]。研究发现，丹参素可延长凝血时间，降低血栓形成风险，为临床指导冠心病抗血小板治疗及个体化临床治疗提供准确信息[8]。以上研究表明，丹参素可改善TEG相关指标，减缓血栓形成，从而延缓冠心病发生发展。正常情况下，心肌组织的氧化与抗氧化处于相对动态平衡状态，氧化应激反应是冠心病心肌缺血的基本病理变化，在动脉粥样硬化发展过程中起着重要作用。研究表明，丹参素衍生物对斑马鱼具有明显抗血栓、抗氧化作用[9]。研究发现，丹参可抑制醛固酮引起的心肌损伤，促进心肌新血管形成，保护心肌[10-11]。本研究结果证实，氧化应激参与冠心病病理过程，导致心肌组织过氧化损伤；丹参素各剂量组SOD和T-AOC活性升高，MDA含量降低，心肌损伤指标CK-MB和cTnI得到有效抑制，心肌细胞凋亡指数降低，且丹参素高剂量组改善效果优于阳性对照组，提示丹参素对冠心病引起的心肌过氧化损伤有保护作用，表明丹参素可能通过抗氧化应激抑制心肌细胞凋亡，减少冠心病病理过程中心肌损伤，保护心肌。

JAK/STAT信号通路在多种生物学进程中起着重要作用，通过磷酸化产生激酶活化级联反应，并将活化的信号传导到下游，引发基因和蛋白水平变化，发挥生物学效应。研究表明，JAK/STAT信号通路在心肌疾病机制中起着重要作用，冠心病引起的心肌功能障碍与此通路密切相关[12-14]。JAK/STAT在心肌缺血期间被激活，冠状动脉持续闭塞后，STAT1和STAT3磷酸化增多，STAT1活化促进凋亡蛋白Caspase-1、Fas和Fal的表达，抑制编码抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x的表达，增加心肌细胞凋亡，导致心肌受损[15-17]。Zhang等[16]研究证实，抑制JAK/STAT通路激活，可减少炎性因子的释放，减轻心肌组织损伤。Abdelsamia等[17]研究显示，姜黄素可通过抑制JAK/STAT通路预防糖尿病性心肌病。本研究结果显示，模型组磷酸化JAK2、STAT1和STAT3蛋白表达与非磷酸化蛋白水平比值明显升高，证实JAK/STAT通路在冠心病发展过程中病理过程被激活；丹参素各剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3比值明显降低，各蛋白磷酸化水平明显降低，同时心肌细胞凋亡指数也明显降低，提示丹参素有抑制p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的作用，表明丹参素可能通过抑制JAK/STAT通路中的关键分子，提高心肌抗氧化能力，减轻冠心病病理过程中心肌损伤。

综上所述，丹参素在大鼠冠心病病理过程中可能是通过JAK/STAT通路抑制JAK2、STAT1和STAT3磷酸化发挥抗氧化及抗栓作用，减轻冠心病大鼠心肌损伤，为临床冠心病的诊治提供理论依据。