基于NLRP3炎症小体探讨电针对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞焦亡的影响

刘孜琦，聂妍琦，傅旖灵，陆梦，郁洁

湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410036

中风是全球范围内第二大致死原因，也是导致残疾的主要因素，其发病率逐年上升，其中大部分为缺血性中风。缺血性中风病理特点是局部脑组织血流量受阻形成梗塞区，恢复缺血脑组织血液供应是缺血性中风治疗的主要措施。目前西医主要采用溶栓治疗，但血液再灌注后可导致脑损伤进一步加重，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。研究表明，CIRI早期以炎症反应为主，CIRI诱导的神经细胞凋亡和神经系统损伤与NLRP3激活密切相关，抑制NLRP3介导的细胞焦亡能发挥神经保护作用。课题组前期研究显示，电针可改善缺血再灌损伤模型大鼠神经功能，抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。本研究通过大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型，进一步探讨电针是否通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡发挥神经保护作用，为明确电针治疗缺血性中风的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

9～10周龄健康SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（230±30）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。分笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心，温度24～26℃，相对湿度50%～70%，12 h光/暗循环，自由摄食饮水。使用许可证号SCXK（湘）2019-0009。实验过程严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》进行。

1.2 药物及试剂

依达拉奉注射液，1.5 mg/mL，货号H20080056，安徽国药集团国瑞药业有限公司。4%多聚甲醛，货号BL539A，北京白鲨易科技有限公司；戊巴比妥钠，货号P3761，上海Sigma-Aldrich；BCA蛋白浓度测定试剂盒，货号PC0020，北京Solarbio；SYBR FAST qPCR Master Mix，货 号KM4101，上 海KAPA Biosystems；蛋白Marker，货号P12103，深圳Helix；化学发光试剂，货号WBKLS0500，上海Millipore；PVDF膜，货号IPVH00010，上海Millipore；吐温-20，货号T8220-100，北京Solarbio；RIPA组织细胞快速裂解液，货号R0010，北京Solarbio；NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白细胞介素（IL）-1β、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG抗体，货号分别为PAB37930、PAB44625、PAB39968、PAB36269、SAB43714，武汉Bioswamp；伊红，货号E8090，北京Solarbio；苏木素，货号G1004，武汉Servicebio；中性树脂，货号G8590，北京Solarbio。

1.3 主要仪器

一次性实验针灸针（0.30 mm×25 mm，苏州医疗用品有限公司），栓线（型号2634-50A4，北京西浓有限公司），电针治疗仪（型号SDZ-Ⅱ，苏州医疗用品厂有限公司），正置显微镜（型号DM1000，上海徕卡显微系统有限公司），恒温烘箱（型号DHG-9023A，上海一恒科学仪器有限公司），石蜡切片机（型号RM2235，上海徕卡显微系统有限公司），生物组织包埋机-冷冻机（型号TB-718L，湖北泰维科技），电泳仪（型号Mini Protean 3 Cell，上海Bio-Rad），酶标仪（型号MK3，芬兰雷勃），干式恒温器（型号K30，杭州爽盛仪器），高速冷冻离心机（型号iCEN-24R，杭州奥盛），全自动化学发光分析仪（型号Tanon-5200，上海天能），PCR仪（型号GE48527，杭州柏恒），荧光定量PCR仪（型号CFX-Connect 96，上海Bio-Rad），超微量分光光度计（型号Nano-300，杭州奥盛）。

1.4 分组及造模

大鼠适应性喂养1周后进行实验，按随机数字表法将60只大鼠分为空白组、模型组、电针组和依达拉奉组，每组15只。除空白组外，采用Longa改良线栓法制备MCAO模型，术前12 h禁食不禁水，1.5%戊巴比妥钠腹腔注射（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠板，剃除颈部毛发，消毒皮肤，颈部正中切开皮肤，沿胸锁乳突肌内缘用止血钳钝性分离皮下筋膜、肌肉及腺体，充分暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，用玻璃分针分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及迷走神经，分别在颈内动脉、颈外动脉挂线备用。结扎颈外动脉近心端，用显微动脉夹暂时夹闭颈内动脉和颈总动脉，在距颈总动脉分叉3 mm处剪一“V”形小口，将栓线由“V”型小口插入颈总动脉至颈内动脉，松开颈内动脉及颈总动脉处显微动脉夹，继续将栓线插入颈内动脉约（18.5±0.5）mm至微感阻力，将颈内动脉远心端处手术线结扎，用以固定栓线。逐层缝合伤口，碘伏消毒伤口及周围皮肤，栓线另一端留l cm置于体外，术后腹腔注射青霉素钠（20万U/只）预防感染。缺血90 min后撤去栓线实现再灌注。空白组只暴露颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及迷走神经，不插入栓线。

大鼠苏醒后根据文献[10]标准进行神经功能缺损评分：0分，无神经缺损症状；1分，不能完全伸展左前肢；2分，走路时身体转向偏瘫侧；3分，行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分，不能自主行走，意识丧失。分别于苏醒后0、24、48 h进行评分，将首次评分为1～3分的大鼠纳入实验。

1.5 干预

电针组参照《实验针灸学》进行腧穴定位，选取左侧“内关”“百会”，用0.30 mm×25 mm针灸针30°斜刺2 mm，正极接左侧“内关”，负极接“百会”，连接电针治疗仪。刺激参数：疏波10 Hz、密波50 Hz，脉冲宽度0.5 ms，电流1 mA。电针组大鼠造模生命体征平稳后（约2 h）进行第1次电针，随后每隔12 h电针1次，20 min/次，共5次。模型组和依达拉奉组在相同时段予固定操作20 min。依达拉奉组大鼠在造模苏醒后即刻一次性腹腔注射依达拉奉注射液（3 mg/kg），模型组和电针组注射等量生理盐水。

1.6 指标检测

1.6.1 HE染色

干预结束后，每组选取3只大鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，断头取脑，切取0.3 cm×0.3 cm大小脑组织，放入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脱水，浸蜡包埋，切片（厚度3 μm），每只大鼠选取3张切片，进行HE染色，光学显微镜下观察，Leica Application Suite图象系统采集图像，观察大脑皮层梗死区病理改变。

1.6.2 TUNEL染色

将固定好的大鼠脑组织常规脱水浸蜡包埋，连续切片（2 μm），水浴展片及烤片，脱蜡处理后，不同浓度酒精水化，滴加Protein K工作液，37℃孵育15 min，加入50 μL TUNEL反应混合液，湿盒避光37℃加盖孵育60 min，PBS冲洗3次，加入50 μL POD-conjugated Anti-FITC工作液，湿盒37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入50 μL DAB底物，室温孵育10 min，苏木素复染，脱水，透明，封片。光学显微镜下观察，以棕黄色颗粒为凋亡阳性表达，每张切片随机选取5个视野，使用Image Pro Plus 6.0软件统计每个视野中凋亡阳性细胞数及细胞总数，计算细胞凋亡率（凋亡阳性细胞数÷细胞总数×100%）。

1.6.3 Western blot检测

剪取200 mg冻存脑组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，4℃、12000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，样品与5×上样缓冲液混合，100℃加热5 min变性；配制12%分离胶、5%浓缩胶进行电泳，20 μg/孔上样，浓缩胶80 V、40 min，分离胶120 V、50 min，当溴酚蓝到达分离胶底部时结束电泳；4℃、100 mA转膜50 min；5%脱脂奶粉4℃封闭过夜；加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH一抗（均为1∶1000），室温孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加HRP标记山羊抗兔IgG（1∶10000），室温孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加ECL化学发光液显色曝光，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，采用TANON GIS软件读取蛋白条带灰度值。

1.6.4 RT-PCR检测

取100 mg脑组织，加入1 mL Trizol研磨成匀浆，12000 r/min离心15 min，提取组织总RNA，按照说明书进行反转录，将cDNA进行PCR扩增：95℃预变性3 min，95℃变性5 s，59℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40个循环。采用CFX Manager 3.1软件获取Ct值，以GAPDH为 内 参，2法 计 算NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量。PCR引物由武汉天一华煜基因科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型大鼠神经功能缺损评分的影响

造模后0 h，各组大鼠神经功能缺损评分较空白组均显著升高（＜0.01），提示造模成功；与模型组比较，电针组和依达拉奉组大鼠造模后24、48 h神经功能缺损评分显著降低（＜0.05，＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠造模后不同时点神经功能缺损评分比较［M（Q1，Q3），分］

2.2 电针对模型大鼠大脑皮层病理变化的影响

HE染色结果显示，空白组大鼠大脑皮层神经元密集、排列规则，胞质丰富，核仁明显，未见病理损伤；模型组大鼠大脑皮层神经元排列紊乱，染色质皱缩，胞体膨大变形，部分可见细胞膜破裂，有空泡，周围尼氏体消失，部分神经细胞萎缩及坏死，有大量小胶质细胞，微血管增多；电针组大鼠大脑皮层病变情况较模型组减轻，细胞排列较整齐，少量神经细胞坏死，神经细胞形态有明显改善，有少量小胶质细胞；依达拉奉组大鼠大脑皮层病理损伤较模型组显著减轻，神经细胞排列整齐、结构清晰，胞浆丰富。见图1。

图1 各组大鼠大脑皮层形态（HE染色，×400）

2.3 电针对模型大鼠脑组织细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，与空白组比较，模型组大鼠脑组织细胞凋亡率显著升高（＜0.01）；与模型组比较，电针组和依达拉奉组大鼠脑组织细胞凋亡率显著降低（＜0.01）。见表3、图2。

图2 各组大鼠脑组织凋亡阳性表达（TUNEL染色，×200）

表3 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较（±s，%）

2.4 电针对模型大鼠脑组织NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白细胞介素-1β蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，电针组和依达拉奉组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达显著降低（＜0.01），且依达拉奉组各指标低于电针组，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见图3、图4。

图3 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白免疫印迹

图4 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达比较（±s，每组15只）

2.5 电针对模型大鼠脑组织NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白细胞介素-1β mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达显著升高（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，电针组和依达拉奉组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达显著降低（＜0.05，＜0.01），且依达拉奉组各指标低于电针组，差异有统计学意义（＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达比较（±s，每组15只）

3 讨论

缺血性中风病因主要为风、火、痰、瘀、虚，病机多属本虚标实。《医林改错》有“无气则不能动，不能动，名曰半身不遂，不遂者，不遂人用也”，将中风表现的临床症状归于气虚不达所致。现代研究表明，元气亏损是缺血性脑卒中的主要原因，气行则血行，气为血之帅，因此气虚则血虚，脉道失荣。《针灸大成》有“中风将至，病浅症轻，时发时止，若有若无，其因不明，此时若施以针灸，投以重剂，恐伤气血，又虑虚实之诫，误酿痼疾”，强调中风的病性为本虚标实，以虚为主，忌投以重剂。

本实验参考前期研究选取“百会”“内关”进行电针干预，进一步揭示电针对缺血再灌注损伤模型大鼠的保护机制。百会为诸阳之会，督脉要穴，全身各部阳气皆汇集于此，《会元针灸学》有“百会者，五脏六腑奇经三阳百脉之所会”，刺激百会可调动百脉之气，补阳调阴。研究发现，百会具有醒神开窍、益精调神作用。百会位于巅顶，百会之下则为脑，《本草纲目》“脑为元神之府”，而心主神志，心藏神，心脑同治也。“人之元神藏于脑，人之识神发于心”（《医学衷中参西录》），故取手厥阴心包经穴内关相配，手厥阴心包经起于胸中，出属心包络，下膈，历络三焦。内关为八脉交会穴、络穴之一，常用于治疗心脏疾病及部分神志病证，具有宁心定志作用。且内关与阴维脉相通，通过络脉与三焦贯通，调理三焦气机，运行气血，故针刺内关可调心以醒脑。百会、内关二穴相配，可达开窍醒神、活血祛风之功。本研究中，电针干预后模型大鼠神经功能缺损评分显著低于模型组，且与依达拉奉组无明显差异。HE染色显示，模型组大鼠大脑皮层神经细胞排列紊乱，细胞萎缩及坏死，神经元核固缩及变形，电针组大鼠脑组织病理损伤明显减轻，提示电针能降低大鼠脑组织损伤，改善神经细胞形态，发挥神经保护作用。

CIRI发病机制复杂，炎症反应和细胞焦亡是其过程中的关键环节，其中，炎症反应在CIRI早期发挥重要作用。NLRP3炎症小体是脑血管疾病产生的最广泛的复合小体之一，在大脑中大量表达，能够识别缺血性中风期间细胞损伤，并调节缺血再灌注损伤引起的炎症反应。NLRP3炎症小体由NLRP3（3个结构域及NLR寡聚化形成炎症小体的核心结构）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前体（pro-Caspase-1）组成，可以增加促炎细胞因子的产生和分泌，导致细胞凋亡和细胞焦亡的程序性死亡。细胞焦亡作为具有炎症性特点的细胞死亡形式，可介导炎症反应的发生，加剧CIRI。细胞焦亡依赖于经典的Caspase-1通路，细胞内的模式识别受体作为感受器识别细胞外信号，通过接头蛋白ASC与pro-Caspase-1结合，形成多蛋白复合物，使Caspase-1活化。活化的Caspase-1一方面对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞，扩大炎症反应；另一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，导致细胞焦亡。NLRP3是细胞焦亡的关键蛋白，可与ASC相互作用，招募pro-Caspase-1，通过上述Caspase-1经典焦亡通路，将焦亡信号传递到下游焦亡蛋白，最终发生细胞焦亡。TUNEL染色观察显示，电针可抑制模型大鼠脑组织细胞凋亡，但由于TUNEL染色是细胞凋亡的主要评价方法，无法特异性评价焦亡情况，因此通过Western blot和PCR实验，进一步检测焦亡相关分子的表达。结果表明，模型组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表达显著升高，提示出现细胞焦亡；电针组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表达显著降低，推测电针可能通过抑制NLRP3炎症小体阻止Caspase-1活化，减少促炎因子IL-1β的分泌，抑制细胞焦亡。

综上，电针“百会”“内关”对脑缺血再灌注损伤大鼠可发挥神经保护作用，其机制可能与抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，减轻CIRI有关。但电针对NLRP3炎症小体的具体抑制途径及对其他细胞焦亡通路的调节作用仍有待今后深入研究。