基于含量测定和化学计量法的地骨皮多指标成分分析

王亚飞，杨平荣，，杨耘，宋平顺，倪琳

1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省药品检验研究院，国家食药监局中药材中药饮片质量重点控制实验室，甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，甘肃省中药品质与安全评价工程技术研究中心，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省妇幼保健院药学部，甘肃 兰州 730000

地骨皮为茄科植物枸杞Mill.或宁夏枸杞L.的干燥根皮，主产于山西、河北、河南、甘肃、宁夏及华北等地，味甘、性寒，归肺、肝、肾经，有凉血除蒸、清肺降火功效，主要用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咯血及内热消渴等。现代药理学研究发现，地骨皮具有降低血糖、降血压、解热镇痛、免疫调节、抗菌等作用。地骨皮的主要成分包括黄酮、有机酸、多肽类、甾醇、香豆素和挥发油，然而地骨皮的有效成分尚不明确，2020年版《中华人民共和国药典》（一部）未规定含量测定项。

地骨皮甲素和地骨皮乙素为精胺生物碱，具有纠正免疫紊乱、降血压、保护NMDA诱导的原代神经元损伤等作用。阿魏酸、咖啡酰丁二胺、N-反式阿魏酰酪胺、绿原酸和肉桂酸等为酚酰胺类和酚酸类化合物。酚酰胺类和酚酸类化合物具有降血压、抗炎、抗氧化和保护小胶质细胞等药理活性。东莨菪亭为香豆素类化合物，香豆素类化合物具有广泛的药理活性，如抗炎、退热、镇静等。本研究采用HPLC对不同产地的42批地骨皮进行研究，建立地骨皮中8种化学成分含量测定的方法，并采用主成分分析、聚类分析和偏最小二乘判别分析等化学计量学方法进行分析，为地骨皮的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国Waters公司，型号ACQUITYARC），电子天平（德国赛多利斯公司，型号QUINTIX224-1CN、secura125-1cn），Synergi 4u Hydro-RP80A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

地骨皮甲素（批号W01N9Z73848），上海源叶生物科技有限公司，含量≥98%；地骨皮乙素（批号P25F11F108939），上海源叶生物科技有限公司，含量≥98%；咖啡酰丁二胺（批号DST200512-015），成都德思特生物技术有限公司，含量≥98%；绿原酸（批号110753-201817），中国食品药品检定研究院，含量以96.8%计；东莨菪亭（批号BP1275），成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度＞98%；阿魏酸（批号110773-201915），中国食品药品检定研究院，含量以99.4%计；N-反式阿魏酰酪胺（批号WK920033108），四川省维克奇生物科技有限公司，含量≥98%；肉桂酸（批号110786-201604），中国食品药品检定研究院，含量以98.8%计。乙腈（批号JA106730），美国supelco公司，色谱纯；三氟乙酸（批号G2023076），阿拉丁试剂（上海）有限公司，色谱纯；超纯水（批号SC10613102200012），屈臣氏。

地骨皮样品共42批，本实验室于2019－2021年采集，经甘肃省药品检验研究院马潇主任鉴定为茄科植物枸杞Mill.或宁夏枸杞L.的干燥根皮，产地信息见表1。

表1 42批地骨皮样品产地信息

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照品溶液制备

分别取咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、东莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺0.51 mg、绿原酸6.97 mg、地骨皮乙素10.68 mg、地骨皮甲素2.03 mg、东莨菪亭0.03 mg、阿魏酸0.03 mg、肉桂酸0.01 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.01 mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备

取样品粉末（过3号筛）约1.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50 mL，加热回流1 h，过滤后将滤液蒸干，残留物用甲醇溶解，定容至2 mL，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.3 色谱条件

采用Synergi 4u Hydro-RP80A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.5%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，10%A；3～20 min，10%～11%A；20～30 min，11%～12%A；30～50 min，12%～14%A；50～60 min，14%～16%A；60～70 min，16%～18%A；70～80 min，18%～10%A），柱 温30℃，流速1.0 mL/min，检测波长278 nm。理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。色谱图见图1。

图1 地骨皮中8种成分HPLC图

2.1.4 线性关系考察

精密取各对照品适量，加甲醇溶解，配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺3.01 mg、绿原酸35.88 mg、地骨皮乙素20.15 mg、地骨皮甲素4.12 mg、东莨菪亭0.15 mg、阿魏酸0.13 mg、肉桂酸0.04 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.04 mg的混合对照品贮备液，分别精密吸取上述混合对照品贮备液，用甲醇稀释成1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样，以各对照品峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，8种成分的回归方程、相关系数及线性范围见表2，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表2 8种成分线性关系考察结果

2.1.5 精密度试验

分别吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，每次10 μL，测得咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、东莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面积RSD分别为0.78%、0.45%、0.67%、1.43%、0.97%、0.49%、1.78%、2.01%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

精密称取地骨皮药材粉末，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样，测得咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、东莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺含量的RSD分别为1.36%、1.75%、0.35%、0.78%、1.23%、1.66%、1.29%、1.37%，表明该方法重复性好。

2.1.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、8、12 h进样10 μL，测得咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、东莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面积的RSD分别为1.28%、1.05%、1.92%、1.73%、0.29%、1.34%，表明供试品在12 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取各成分含量已知的样品（22号）粉末18份，每份约0.75 g（分别含咖啡酰丁二胺0.79 mg、绿原酸8.48 mg、地骨皮乙素13.47 mg、地骨皮甲素3.00 mg、东莨菪亭0.035 mg、阿魏酸0.031 mg、肉桂酸0.006 mg和N-反式阿魏酰酪胺0.002 mg），分为3组，分别加入各成分含量已知的高（120%）、中（100%）、低（80%）浓度混合对照品溶液1 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样，计算加样回收率，结果见表3。

表3 8种成分加样回收率试验结果（n=6）

2.1.9 样品含量测定

取不同产地样品粉末（过3号筛）各约1.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，分别记录8种成分的峰面积，以外标法计算各成分含量，结果见表4。可以看出，地骨皮样品中8种成分的含量跨度均较大，故采用化学计量学方法对不同产地地骨皮样品中8种成分含量数据进行分析。

表4 地骨皮样品中8种成分含量测定结果（mg/g，n=3）

2.2 化学计量学分析

2.2.1 聚类分析

运用SPSS25.0统计软件对不同产地地骨皮8种成分含量进行聚类分析。以平方欧氏距离计算，连接方法为平均联接，不同产地地骨皮中8种成分含量的系统聚类分析结果见图2。可以看出，不同产地的地骨皮可以被较好地分开。当类间距离为12～25时，样品可分为两类：一类为甘肃、宁夏、河北样品，一类为安徽、湖北样品。当类间距离为5时，样品可分为4类：一类为甘肃样品，一类为安徽样品，一类为湖北样品，最后一类包含甘肃、宁夏和河北样品；当类间距离为2时，该类样品可独立分为甘肃、宁夏、河北样品。除6号和36号样品外，其余40批样品的聚类结果均与产地具有良好相关性。

图2 不同产地地骨皮样品8种成分含量系统聚类分析

2.2.2 各成分含量散点

运用Graphpad Prism 8软件绘制不同产地地骨皮样品中8种成分含量的散点图，结果见图3。可直观看出不同产地地骨皮各成分含量的差异。其中，咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素和地骨皮甲素4种成分的含量随产地的变化较为明显：甘肃、宁夏和河北的样品含量相近且较低，安徽的样品含量高于甘肃、宁夏和河北，湖北的样品含量最高。东莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺4种成分含量的产地差异不明显，除个别样品外，其余含量均较在小范围内波动。表明在本试验所测定的8种成分中，前4种成分与产地相关性较强。

图3 不同产地地骨皮样品8种成分含量散点（mg/g）

2.2.3 主成分分析

运用SPSS25.0和SIMCA13.0软件进行主成分分析（PCA），结果见图4。可以看出，除宁夏和湖北的样品有部分重叠之外，其他几个产地的地骨皮可较好分开。采用最大方差法对特征值及因子载荷矩阵进行旋转解输出，结果见表5、表6。依据表5的特征值和贡献率分析，前3个特征值均大于1，且分别代表了变量总方差的45.329%、17.868%、13.586%，累计贡献率达76.782%，可以代表地骨皮的整体信息，客观反映了样品的内在质量，故选择前3个主成分因子进行分析。由表6可知，主成分1中咖啡酰丁二胺、绿原酸和地骨皮乙素的贡献值较大，主成分2中肉桂酸的贡献值较大，主成分3中阿魏酸的贡献值较大。

图4 不同产地地骨皮样品PCA散点

表5 不同产地地骨皮样品PCA特征值和贡献率

表6 不同产地地骨皮样品PCA旋转变换后的因子载荷矩阵

2.2.4 偏最小二乘判别分析

运用SIMCA13.0软件进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），建立监督模式识别方法的PLS-DA模型。模型共提取3个主成分，X矩阵解释率RX为0.717，模型稳定性参数RY为0.384，模型预测能力参数Q为0.15，表明所建的PLS-DA模型解释率和预测率一般。设置分类Y矩阵变量随机排列200次做置换检验，结果见图5。R拟合直线在Y轴的截距为0.0735＜0.3，Q拟合直线在Y轴的截距为-0.211＜0.05，说明所建模型可靠，不存在过度拟合现象。PLS-DA散点见图6。可以看出，42批样品仅有3批不在95%置信区间内，除宁夏和河北样品有部分重叠外，其余产地样品均可明显区分。变量重要性投影（VIP）可直观体现各元素引起样品差异的权重大小，元素VIP值＞1表明其对样品分类结果权重影响率＞50%，即对分类结果影响具有统计学意义，为差异标志物。8种成分VIP见图7。42批地骨皮的差异标志成分为绿原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和东莨菪亭。

图5 不同产地地骨皮样品PLS-DA置换检验

图6 不同产地地骨皮样品PLS-DA散点

图7 不同产地地骨皮样品8种成分VIP

3 讨论

本试验比较了不同类型的C18柱对地骨皮成分的分离效果，普通的C18柱对地骨皮甲素、地骨皮乙素等成分分离效果较差，飞诺美的C18端基封尾柱对地骨皮中各成分分离效果较好。此外，本试验采用不同比例的甲醇为提取溶剂在同一提取方法下进行提取，发现甲醇提取的样品中各峰面积相对较高；比较了不同提取方法（超声法、热回流法、冷浸法）下的提取率和色谱峰情况，发现热回流法提取的色谱峰基线较平稳且峰面积相对较高；比较了不同波长下各物质的吸收峰，发现在278 nm波长处各物质均具有较强的吸收。所以采用上述各项最佳条件作为最终试验条件。

在本试验的提取条件和色谱条件下，咖啡酸和香草酸均有较好的提取率和紫外吸收，但因为咖啡酸和香草酸在此液相条件下出峰时间几乎相同，故试验中将这2种成分删去。今后可通过优化液相条件，将咖啡酸和香草酸作为检测指标。

本研究建立PLS-DA模型对不同产地地骨皮样品进行分析，模型预测参数＜0.5，但依据散点图可知，除宁夏和河北两地样品有重叠外，甘肃、湖北和安徽的样品均能被较好地判别，所以该模型仍可在本试验涵盖范围内被用于未来地骨皮样品产地的初步判别或依据产地初步估算地骨皮中多种成分的大致含量。

赵晓玲等测定了不同来源地骨皮中地骨皮甲素、地骨皮乙素以及阿魏酸的含量，但因为对照品浓度以及测定条件等原因，作者将地骨皮甲素和地骨皮乙素作为同一指标进行了检测。苏磊等测定了地骨皮中咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和绿原酸的含量。张华磊等测定了地骨皮中东莨菪内酯的含量。本试验在相关研究基础上，对试验条件进行了探索和优化，建立了同时测定地骨皮中8种化学成分含量的方法，选取5个省份的样品进行检测，并对结果进行了多种化学计量学分析，结果表明对产地影响较大的主成分为咖啡酰丁二胺、绿原酸、地骨皮乙素、肉桂酸和阿魏酸5种；42批地骨皮样品依据产地分类，其差异标志成分为绿原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和东莨菪亭5种。在PCA和PLS-DA中，除宁夏和河北两地的样品有部分重叠外，其余产地的地骨皮样品分类效果均较好。

本试验建立HPLC方法同时对地骨皮中8种成分的含量进行测定，该方法可用于地骨皮药材质量的全面评价。结合化学计量学分析可知不同产地的地骨皮药材存在较明显质量差异，所以地骨皮药材的产地溯源是必要的。但本试验收集的地骨皮样品产地仅有5个省份，而对河南、山西等主要产区未涉及，今后需进一步拓宽样品产地。本试验对甘肃、安徽和湖北三地的样品分类效果较好，宁夏和河北样品存在部分重叠，提示所测定的8种成分并非不同产地样品的全部差异性数据，对于不能较好区分产地的样品，可进一步研究其无机元素含量、红外光谱等以进行区分。