基于FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路探讨芪参汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏炎症的影响

李琨，王炳予，张雅丽，刘长发，袁星星，3

1.北京开放大学，北京 100081；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150006

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）又称代谢相关脂肪性肝病，是指除酒精和其他明确的损肝因素外所导致的脂肪组织在肝内堆积过多，出现全身代谢障碍的病理综合征。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）属于NAFLD疾病谱范畴，是由单纯性肝脏脂肪变发展而来，以肝内脂质蓄积和大量炎症细胞浸润为特征，进而导致肝细胞损伤、坏死和纤维化。目前NAFLD全球发病率约25%，人数已超过17亿，且发病率逐年升高，已成为我国第一大慢性肝脏疾病。2019年调查结果显示，我国NAFLD发病率约29.2%，不仅严重危害患者生命健康，也给社会带来沉重的负担。

NAFLD发病机制复杂，目前尚缺乏有效的治疗药物。中医以辨证论治为基础，对NAFLD的整体调治具有独特优势。NAFLD属中医学“胁痛”“肝癖”等范畴，多由饮食失节、劳逸失常及情志失畅引起，以致脾失健运，脾气虚无力运化水谷精微，生化乏源，水谷精微不能正常输布，致内生痰湿，久之成瘀，痰瘀互结于肝之脉络发为本病。芪参汤为临床治疗NAFLD的经验方，由《博爱心鉴》保元汤化裁而来，具有益气健脾、祛瘀化痰功效。本课题组前期研究表明，芪参汤可通过调控肠道菌群多样性与稳态，发挥改善NASH患者肝功能、血脂异常和纤维化的作用。药理实验结果显示，芪参汤可通过抑制胰岛素通路活化改善NAFLD胰岛素抵抗，进而改善肝脏脂肪沉积和肝损伤。本研究以FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路为切入点，进一步明确芪参汤抑制肝脏炎症的作用机制，为NAFLD治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源与处理

采用GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）编号为GSE126848的数据集，该数据集包含57个肝组织样本，其中14个健康正常体质量样本、12个肥胖样本、15个非酒精性肝脏脂肪变样本、16个NASH样本。通过R软件Limma包对数据进行补缺、校正及归一化。在此基础上，通过贝叶斯检验以＜0.05和|LogFC|≤1为条件对差异基因进行筛选。

1.2 动物及细胞

6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠100只，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011，动物使用许可证号SYXK（黑）2016-008。饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心，温度21.5～25.5℃，湿度45.0%～55.0%，12 h光暗循环，自由摄食饮水。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，美国ATCC细胞库。

1.3 主要试剂与仪器

脂肪酸结合蛋白4（FABP4）抑制剂BMS-309403，美国MCE公司，货号HY-101903；HE染液、油红O染液、SYBR Green OneStep qRT-PCR试剂盒，上海碧云天生物，货号分别为C0105S、C0157M、D7268S；小鼠白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、CXC趋化因子受体3（CXCR3）、趋化因子C-C-基元配体4（CCL4）试剂盒，江苏酶免实业有限公司，货号分别为MM-0132M2、MM-0040M2、MM-0153M2、MM-0016M2；细胞核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒，福州飞净生物，货号PH0710；反转录试剂盒，日本TaKaRa公司，货号RR036A；FABP4抗体、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ抗体、κB抑制因子激酶（IKK）α抗体、核因子（NF）-κB抑制因子（IκB）α抗体、p-IκBα（Ser32）抗体、NF-κB p65抗体、Histone H3抗体、β-actin抗体，美国CST公司，货号分别为2120、2430、2682、4812、2859、8242、4499、3700；p-IKKα（Ser176）抗 体、HRP标记羊抗兔IgG，英国Abcam公司，货号分别为ab138426、ab6721；Ly6C抗体、F4/80抗体，美国eBioscience公 司，货 号 分 别 为14-5931-82、MF48005。CX33光学显微镜，日本Olympus公司；Cobas8000全自动生化分析仪，德国Roche公司；电泳仪、电泳槽，美国Bio-Rad公司；iBright CL1500凝胶成像系统、Attune Nx T流式细胞仪、Varioskan LUX多功能酶标仪，美国Thermo Fisher公司。

1.4 药物及含药血清制备

芪参汤由黄芪、西洋参、丹参、山楂、荷叶、泽泻、女贞子、三七、墨旱莲、绞股蓝、甘草按15∶10∶10∶10∶10∶10∶8∶5∶8∶5∶3比例组成，由黑龙江省中医药科学院制剂室经浸泡、煎煮、过滤、浓缩后，制成原药材浓度为1 g/mL浓缩液备用。盐酸二甲双胍片，上海上药信谊药厂有限公司，0.25 g/片，使用前配制成0.013 g/mL混悬液。

取20只小鼠随机分为空白组和芪参汤组，每组10只。芪参汤组参照前期研究得出的最佳剂量予芪参汤浓缩液18.8 g/kg灌胃，给药体积0.376 mL/只。空白组予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续7 d。末次灌胃后，1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉小鼠，腹主动脉采血，3000 r/min离心10 min，取血清，56℃水浴30 min灭活，0.22 μm滤膜过滤后分装冻存。

1.5 分组、造模及干预

将剩余80只小鼠随机分为空白组、模型组、芪参汤组和二甲双胍组，每组20只。除空白组外，其余3组参照文献[12]采用高脂饲料喂养建立NAFLD小鼠模型。造模同时进行干预，芪参汤组予芪参汤浓缩液18.8 g/kg灌胃，二甲双胍组予二甲双胍混悬液0.25 g/kg灌胃，空白组和模型组予生理盐水灌胃，给药体积均为0.376 mL/只，每日1次，连续16周。分别于第12、16周末随机取10只小鼠以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血后，分离肝脏，用于后续检测。以第12周肝组织油红O染色出现脂滴形成为单纯性脂肪变、第16周HE染色可见炎症细胞浸润及纤维化为NASH判定标准。

RAW264.7细胞用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清、1%双抗），置于37℃、5%CO培养箱中培养。取对数生长期细胞，以1×10个/孔接种于96孔板，置于37℃、5%CO培养箱中培养12 h，弃上清液，将细胞分为空白组、模型组、芪参汤组和抑制剂组，每组3个复孔。除空白组外，其余3组加入500 μmol/L棕榈酸诱导细胞炎症模型，芪参汤组同时加入100 μL 10%芪参汤含药血清，抑制剂组加入20 μmol/L BMS-309403，空白组和模型组加入100 μL 10%空白血清，置于培养箱培养24 h，收集细胞和上清液进行检测。

1.6 检测指标

1.6.1 肝组织病理观察

分别于第12、16周取小鼠部分肝脏，中性甲醛固定6 h，石蜡包埋，切片后行HE染色。另取部分肝脏以OCT包埋，冰冻切片，中性甲醛固定30 min，行油红O染色。光学显微镜下观察，参照文献[14]方法计算NAFLD活动积分（NAS）。①肝脂肪变评分。肝脂肪变程度＜5%，0分；5%≤肝脂肪变程度≤33%，1分；34%≤肝脂肪变程度≤66%，2分；肝脂肪变程度＞66%，3分。②肝小叶内炎症评分。肝小叶内炎症（200倍视野）＜2个，0分；2≤肝小叶内炎症≤4个，1分；肝小叶内炎症＞4个，2分。③肝细胞气球样变性评分。无肝细胞气球样变性，0分；少量肝细胞气球样变性，1分；较多肝细胞气球样变性，2分。NAS=肝脂肪变评分+肝小叶内炎症评分+肝细胞气球样变性评分。同时，采用Image J 1.8.0软件计算油红O染色面积。

1.6.2 肝功能检测

第12、16周腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，收集血清，全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。

1.6.3 ELISA检测

第12、16周腹主动脉取血，室温、3500 r/min离心10 min，收集血清。另收集细胞培养上清液，酶标仪测定血清及上清液炎症因子IL-1β、TNF-α及趋化因子CXCR3、CCL4含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.6.4 Western blot检测

分别取肝组织和RAW264.7细胞，加入RIPA裂解液，冰上匀浆，3000 r/min离心5 min，取上清液，双金鸡纳酸法测定蛋白浓度。取15 μg蛋白上样，电泳，转膜，以5%脱脂牛奶封闭1 h，肝组织蛋白样品滴加FABP4一抗（1∶1000），细胞蛋白样品滴加FABP4一抗（1∶1000）、PPAR-γ一抗（1∶1000）、p-IKKα一抗（1∶500）、p-IκBα一抗（1∶1000）、IKKα一抗（1∶1000）、IκBα一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶1000），4℃孵育过夜，加入HRP标记羊抗兔IgG（1∶2000），室温孵育1 h，滴加超敏ECL显影液，室温静置2 min，采用凝胶成像系统进行扫描分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

另外，通过试剂盒分离细胞质与细胞核蛋白，分别加入NF-κBp65一抗（1∶1000）、HistoneH3一抗（1∶2000）、β-actin一抗（1∶1000），并按上述步骤处理，以Histone H3为细胞核蛋白内参，β-actin为细胞质蛋白内参，计算NF-κB p65蛋白相对表达量。

1.6.5 qRT-PCR检测

分别取肝组织和RAW264.7细胞，采用Trizol法提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Green OneStep qRT-PCR试剂盒说明书配制反应体系。反应条件：95℃预变性8 min，95℃变性15 s，60℃退火65 s，共40个循环；终末60℃补延伸10 min。以GAPDH为内参，采用2法计算mRNA表 达 量。引 物 序 列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.6 流式细胞术检测

收集各组细胞，3000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加入Ly6C-PE和F4/80-APC一抗，避光孵育30 min。PBS洗涤，3000 r/min离心5 min，弃上清液，多聚甲醛重悬，流式细胞仪进行检测。先选取F4/80阳性细胞群，再根据Ly6C荧光强度分为Ly6C和Ly6C巨噬细胞亚群。通过FlowJo 10.4软件计算各亚群比例。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 差异基因筛选结果

将GSE126848数据集中14个健康正常体质量样本和12个肥胖样本定义为Health，15个单纯脂肪病变和16个NASH样本定义为NAFLD。共筛选出1246个差异基因，其中493个上调、753个下调（见图1）。差异表达基因中，FABP4水平在NAFLD演变过程中逐渐升高，因此本研究主要对FABP4表达及功能展开研究。

图1 GSE126848数据集NAFLD差异表达基因热图

2.2 芪参汤对模型小鼠肝组织病理形态的影响

HE染色和油红O染色显示，第12周空白组小鼠肝小叶结构清晰、完整，肝细胞排列整齐；模型组小鼠肝细胞明显肿胀，呈气球样变，有大量脂滴形成；芪参汤组和二甲双胍组小鼠肝细胞肿胀、气球样变及脂质堆积有所改善。第16周模型组小鼠肝小叶结构紊乱，出现大量气球样变，炎症细胞局部浸润，肝细胞内有大量红色脂滴；芪参汤组和二甲双胍组小鼠肝脏脂肪变程度、炎症细胞浸润和脂滴较模型组明显减少。见图2、图3。

图2 各组小鼠肝组织形态（HE染色，×400）

图3 各组小鼠肝组织形态（油红O染色，×400）

与空白组比较，模型组小鼠第12、16周NAS和油红O染色面积显著增加（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和二甲双胍组小鼠第12、16周NAS和油红O染色面积显著减少（＜0.01，＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠不同时点NAS和油红O染色面积比较（±s）

2.3 芪参汤对模型小鼠肝功能及血清细胞因子的影响

与空白组比较，模型组小鼠第12、16周血清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和二甲双胍组小鼠 第12、16周 血 清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量显著减少（＜0.05，＜0.01）。见表3、表4。

表3 各组小鼠不同时点肝功能指标比较（±s，U/L）

表4 各组小鼠不同时点血清细胞因子含量比较（±s，pg/mL）

2.4 芪参汤对模型小鼠肝组织脂肪酸结合蛋白4表达的影响

Western blot和qRT-PCR结果显示，与空白组比较，模型组小鼠第12、16周肝组织FABP4蛋白和mRNA表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和二甲双胍组小鼠第12、16周肝组织FABP4蛋白和mRNA表达显著降低（＜0.01）。见表5、图4。

表5 各组小鼠不同时点肝组织FABP4表达比较（±s）

图4 各组小鼠肝组织FABP4蛋白免疫印迹

2.5 芪参汤对RAW264.7细胞上清液细胞因子含量的影响

与空白组比较，模型组细胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量增加，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和抑制剂组细胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量减少，差异有统计学意义（＜0.01）。见表6。

表6 各组RAW264.7细胞上清液细胞因子含量比较（±s，pg/mL）

2.6 芪参汤对RAW264.7细胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组细胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及细胞核NF-κB p65蛋白表达显著升高，PPAR-γ、IκBα及细胞质NF-κB p65蛋白表达显著降低（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和抑制剂组细胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及细胞核NF-κB p65蛋白表达显著降低，PPAR-γ、IκBα及细胞质NF-κB p65蛋白表达显著升高（＜0.01）。各组IKKα蛋白差异无统计学意义（＞0.05）。见图5、表7。

表7 各组RAW264.7细胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路相关蛋白表达比较（±s）

图5 各组RAW264.7细胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB通路相关蛋白免疫印迹

2.7 芪参汤对RAW264.7细胞Ly6Clow和Ly6Chigh亚群比例的影响

流式细胞术结果显示，与空白组比较，模型组细胞Ly6C亚群比例显著减少，Ly6C亚群比例显著增加（＜0.01）；与模型组比较，芪参汤组和抑制剂组RAW264.7细胞Ly6C亚群比例显著增加，Ly6C亚群比例显著减少（＜0.01）。见图6、表8。

表8 各组RAW264.7细胞Ly6Clow和Ly6Chigh亚群比例比较（±s，%）

图6 各组RAW264.7细胞F4/80-Ly6C检测流式图

3 讨论

NAFLD发病机制与“二次打击”密切相关，导致炎症介质大量产生，进一步引起炎症坏死及肝纤维化。随着对NAFLD研究的深入，“多重平行打击”学说认为，炎症反应早于单纯脂肪变性并且可导致随后的肝脂肪病变。在炎症应激作用下，脂质代谢相关调节蛋白功能发生障碍，进一步导致肝细胞内脂质代谢稳态失调，从而引起脂质过度蓄积。本研究通过高脂饲料喂养制备NAFLD小鼠模型，12周即可造成单纯性脂肪变，16周可出现典型的NASH病理特征，是目前公认的NAFLD动物模型。结果显示，模型小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-1β含量增加，并通过体循环进入肝脏，进一步加重肝脏炎症损伤与糖脂代谢紊乱。芪参汤干预可显著减少模型小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-1β含量，改善肝脏炎症和脂质代谢紊乱。

巨噬细胞是固有免疫细胞，可分为常驻枯否细胞和从外周募集的单核细胞源性巨噬细胞。肝脏募集的单核源性巨噬细胞通过循环转移并浸润至肝脏组织，通过调节肝脏免疫微环境参与代谢性炎症，促进NAFLD进展。CXCR3作为CXC趋化因子家族的一员，通过CCL4激活并招募单核巨噬细胞到达炎症位点，分泌炎症因子，进一步加重NASH。单核巨噬细胞根据Ly6C水平可分为Ly6C和Ly6C2个亚群，其中Ly6C亚群由Ly6C亚群转化而来，具有抗炎和促进修复作用，Ly6C亚群在损伤应答及趋化信号中富集，表现为促炎作用。Ly6C和Ly6C亚群比例可作为评估肝脏单核源性巨噬细胞功能的重要指标。本研究中，模型组小鼠血清CXCR3、CCL4含量显著增加，芪参汤能显著抑制CXCR3和CCL4分泌，从而抑制单核源性巨噬细胞向肝脏募集。在此基础上，通过棕榈酸诱导构建巨噬细胞炎症模型，流式细胞术结果表明，模型组细胞Ly6C亚群比例减少，Ly6C亚群比例增加，芪参汤干预能显著促进Ly6C亚群向Ly6C亚群转化及炎症因子和趋化因子分泌，发挥抗炎作用。

FABP4主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞，表达于脂肪细胞的FABP4具有调控胰岛素抵抗及糖脂代谢作用，表达于巨噬细胞的FABP4通过促进内质网应激和炎症因子分泌发挥促进炎症反应作用。PPARs属于核激素受体，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ 3种异构体，在胰岛素抵抗、糖脂代谢、炎症反应及肝纤维化中均发挥重要作用。研究表明，FABP4可直接与PPAR-γ结合并促进PPAR-γ降解，FABP4敲除的巨噬细胞PPAR-γ表达显著升高。炎症发生时，IKKα被可游离脂肪酸磷酸化，激活的IKKα进一步磷酸化IκBα/β，使IκBα/β泛素化并被降解，致NF-κB p65和IκBα/β二聚体解离，进而促进NF-κB p65核转位，调控TNF-α、IL-1β等炎症因子产生，加重NAFLD发展。PPAR-γ通过抑制激活蛋白-1、NF-κB及JAK/STAT等途径发挥抑制炎症反应作用。本研究首先通过生物信息学分析NAFLD差异表达基因，筛选出FABP4进行后续研究。动物实验结果显示，NAFLD模型小鼠肝组织FABP4表达显著上调，芪参汤能显著抑制模型小鼠肝组织FABP4表达。因此我们推测，芪芪参汤治疗NAFLD可能与抑制FABP4表达有关。细胞实验进一步显示，模型组RAW264.7细胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和细胞核NF-κB p65蛋白表达显著升高，PPAR-γ、IκBα和细胞质NF-κB p65蛋白表达显著降低。芪参汤干预能显著抑制细胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和细胞核p65蛋白表达，上调PPAR-γ、IκBα和细胞质NF-κB p65蛋白表达，表现出与BMS-309403相同趋势。以上结果提示，芪参汤抑制炎症的机制是通过抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路活化实现的。

综上所述，芪参汤主要通过抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信号通路活化，进而促进Ly6C巨噬细胞亚群向Ly6C巨噬细胞亚群转化，发挥治疗NAFLD炎症的作用。