基于“肠-脑互动”探讨温肾健脾方对脾肾阳虚型腹泻型肠易激综合征大鼠内脏敏感性及c-Fos表达的影响

蒋天媛，牛然，刘倩，罗晓颖，张涛，杨洋，苏晓兰，吴宝麒，韩娟，魏玮

1.北京中医药大学，北京 100029；2.功能性胃肠病中医诊治北京市重点实验室，北京 100102；3.中国中医科学院望京医院，北京 100102；4.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700

腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是临床常见功能性肠病，以腹痛、排便次数增多、大便不成形为主要临床表现，同时缺乏器质性改变。内脏高敏感性被认为是其核心病理机制，包括外周敏化和中枢敏化，内脏高敏在一定程度上是“肠-脑互动”神经信号传递异常的表现之一。背根神经节作为外周神经系统与中枢神经系统信号传递的中转站，在“肠-脑互动”中具有重要作用。海马是与认知相关的重要结构，母婴分离作为早期生活不良事件，对海马中成体神经发生具有抑制效应，并可使海马可塑性降低。机体对伤害性刺激信号的放大可能是敏化的关键环节，c-Fos被认为是细胞内信号级联反应的关键效应因子，应激时可以放大伤害性刺激信号，与内脏高敏感性密切相关，可能成为治疗IBS-D的重要靶点。

IBS-D目前尚无特异性治疗方案，给患者生命健康和生活质量带来严重影响。传统对症治疗主要关注肠道局部症状，难以实现对肠道及中枢的多维调控。课题组前期基于文献研究认为脾肾阳虚是IBS-D反复发作、迁延不愈的重要原因，并基于临床实践归纳提出温肾健脾法，拟温肾健脾方应用于临床，疗效显著。基于此，本实验观察温肾健脾方对脾肾阳虚型IBS-D大鼠粪便性状、内脏敏感性、肠道吸收功能及c-Fos在结肠组织、背根神经节和海马组织表达的影响，基于“结肠-背根神经节-海马”3个环节探讨温肾健脾方改善IBS-D模型大鼠内脏敏感性，缓解IBS-D症状的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

1日龄SPF级雄性SD大鼠32只、12周龄SPF级SD母鼠5只，中国中医医科学院动物实验中心提供，动物许可证号SCKK（京）2012-0004。饲养于中国中医科学院针灸研究所，温度（23±2）℃，相对湿度（60±5）%，12 h昼夜交替。予标准饲料及饮用水喂养。本实验经中国中医科学院针灸研究所实验动物伦理委员会批准（D2021-03-16-3）。

1.2 药物及制备

温肾健脾方（肉豆蔻15 g，补骨脂30 g，五味子9 g，吴茱萸6 g，太子参30 g，白术10 g，郁金18 g，生姜10 g，大枣10 g），复方颗粒购自中国中医科学院望京医院颗粒药房，1剂颗粒相当于原药材12.2 g，使用时加蒸馏水配制成0.11 g/mL溶液。番泻叶颗粒，中国中医科学院望京医院中药配方颗粒药房提供（购自四川新绿色药业科技发展有限公司），取50 g番泻叶颗粒，加入50 mL 100℃饮用水完全溶解，配制成浓度为1 g/mL番泻叶水溶液。匹维溴铵片，法国Mylan Laboratories SAS公司，批号0160396，50 mg/片，将匹维溴铵片研碎后与适量蒸馏水混合，配制成浓度为2.7 mg/mL混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

D-木糖测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号A035-1-1；苏木素染液，武汉云克隆科技股份有限公司，货号C1001；TRNzol Universal Reagent试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司，货号DP424；EasyScrpt One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，北京全式金生物技术有限公司，货号AE311-03；HieffqPCR SYBR Green Master Mix试剂盒，上海翊圣生物，货号11201ES08；c-Fos抗体，英国Abcam，货号ab208942；组织裂解液，武汉云克隆科技股份有限公司，货号A101；BCA总蛋白定量测定试剂盒（微孔板法），武汉云克隆科技股份有限公司，货号A202。Bead Ruptor 12多样品研磨珠均质仪，美国Omni；D3024R台式高速冷冻型微量离心机，北京DragonLab；LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪，瑞士Roche；NanoDrop2000超微量分光光度计，美国Thermo；ELx808酶标仪，美国BioTek；5600F扫描仪，佳能（中国）有限公司；CK31正置光学显微镜，日本奥林巴斯；TVO.63XC-MO成像系统，广州明美。

2 实验方法

2.1 分组与造模

32只大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、匹维溴铵组和温肾健脾方组，每组8只。除正常组外，其余各组采用母子分离联合番泻叶灌胃建立脾肾阳虚型IBS-D大鼠模型：每日上午9:00－12:00将子鼠与母鼠分笼3 h，连续3周；适应性喂养1周；第5周开始予番泻叶水溶液1 g/mL灌胃，灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续6周。

2.2 干预

造模结束后，根据人与大鼠体表面积换算给药剂量，匹维溴铵组予匹维溴铵混悬液13.50 mg/kg灌胃，温肾健脾方组予温肾健脾方溶液1.1 g/kg灌胃，正常组和模型组予生理盐水灌胃，灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续14 d。

2.3 检测指标

2.3.1 粪便性状评分

干预结束后将大鼠单笼饲养，于饲养笼内放置滤纸以观察大鼠粪便性状，并根据Bristol粪便性状量表进行评分：1分，分散的硬块，似坚果；2分，腊肠状，但成块；3分，腊肠状，表面有裂缝；4分，似腊肠或蛇，光滑柔软；5分，软团，边缘清楚；6分，绒状物、边缘不清，糊状便；7分，水样，无固状物。

2.3.2 内脏敏感性检测

干预结束后，参照腹壁撤退反射（AWR）实验方法自制结直肠测压计，测定大鼠内脏敏感性。实验前大鼠禁食不禁水18 h，确认其排尽大便后，将球囊涂抹石蜡油并塞入大鼠肛门约7 cm，在肛门外1 cm处用医用胶带将其固定于大鼠尾根部，将大鼠置于18 cm×8 cm×6 cm特制小笼中，使其不得转头，待其完全平静后缓慢向球囊内充气，观察大鼠腹壁对肠腔球囊扩张刺激的反应。分别使用20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）4个压力，每次扩张持续20 s。AWR评分标准：0分，给予结直肠扩张刺激时大鼠情绪基本稳定；1分，给予刺激时情绪不稳定，偶尔扭动头部；2分，腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；3分，腹背部肌肉较强烈收缩且腹部抬离地面；4分，腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形且腹部、会阴部抬离地面。

2.3.3 肠道吸收功能检测

大鼠先予5%D-木糖溶液0.3 g/kg灌胃，1 h后腹腔注射5%异戊巴比妥（4 mL/kg）麻醉，仰卧固定于平板上，腹主动脉取血5～8 mL，室温静置20 min，3000 r/min离心15 min，收集上清液，采用生化法检测血清D-木糖含量。

2.3.4 HE染色

取距肛门5～8 cm处结肠组织，生理盐水冲洗干净，置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片（厚度2 μm），常规HE染色，用CaseViewer 2.1软件观察结肠组织病理变化。

2.3.5 qRT-PCR检测

取距肛门3～5 cm处结肠组织；参照文献[14-15]分离背根神经节；断头取脑，距离大脑皮质后缘约5 mm位置沿中弧线用刀片切开，将切开的皮质钝性分离后取海马。分别将结肠组织、背根神经节、海马组织置于2 mL冻存管中，放入液氮中暂存，后转至-80℃冰箱保存。

采用Trizol法提取总RNA，按照42℃、15 min，85℃、5 s反应程序将RNA反转录为cDNA。加入相应引物和荧光染料扩增，反应条件：95℃、5 min，95℃、5 s，55℃、30 s，72℃、20 s，共44个循环。采用2法计算mRNA相对表达量，引物由通用生物系统（安徽）有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.6 Western blot检测

将组织剪成小块，按1∶20加入预冷的裂解液，充分裂解后，4℃、10000 r/min离心5 min，取上清液，BCA法测定蛋白含量；将蛋白样品与上样缓冲液按4∶1混合，蛋白变性后上样，进行凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，PBST摇床震荡洗涤3 min×2次；加入c-Fos一抗（1∶1000），37℃摇床孵育120 min，PBST摇床震荡洗涤3 min×2次；加入二抗，37℃孵育60 min，PBST摇床震荡洗涤3 min×2次；ECL试剂盒显影，凝胶成像系统进行分析。以GAPDH为内参，Image J1.8.0软件分析条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比值计算蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 温肾健脾方对模型大鼠Bristol粪便性状评分的影响

与正常组比较，模型组大鼠Bristol粪便性状评分显著增加（＜0.01）；与模型组比较，温肾健脾方组大鼠Bristol粪便性状评分显著减少（＜0.01）；与匹维溴铵组比较，温肾健脾方组大鼠Bristol粪便性状评分显著减少（＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠Bristol粪便性状评分比较（±s，每组8只）

4.2 温肾健脾方对模型大鼠腹壁撤退反射评分的影响

与正常组比较，模型组大鼠20、40、60、80 mm Hg压力水平下AWR评分均显著增加（＜0.01）；与模型组比较，温肾健脾方组大鼠20、40、60、80 mm Hg压力水平下AWR评分均显著减少（＜0.01）；与匹维溴铵组比较，温肾健脾方组大鼠40 mm Hg压力水平下AWR评分显著减少（＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同压力水平下AWR评分比较（±s，分）

4.3 温肾健脾方对模型大鼠血清D-木糖含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清D-木糖含量显著减少，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，匹维溴铵组和温肾健脾方组大鼠血清D-木糖含量显著增加，差异有统计学意义（＜0.01）；与匹维溴铵组比较，温肾健脾方组大鼠血清D-木糖含量显著增加，差异有统计学意义（＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠血清D-木糖含量比较（±s，每组8只）

4.4 温肾健脾方对模型大鼠结肠组织病理形态的影响

正常组大鼠结肠黏膜完整，上皮细胞排列整齐，形态一致，未见糜烂、溃疡病变；模型组大鼠结肠黏膜可见轻度水肿，上皮细胞排列紊乱；匹维溴铵组和温肾健脾方组大鼠结肠组织病变有不同程度改善。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织形态（HE染色，×80）

4.5 温肾健脾方对模型大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，匹维溴铵组和温肾健脾方组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与匹维溴铵组比较，温肾健脾方组大鼠结肠组织c-Fos mRNA表达显著降低（＜0.01），海马组织c-Fos mRNA表达显著升高（＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠不同组织c-Fos mRNA表达比较（±s）

4.6 温肾健脾方对模型大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，匹维溴铵组和温肾健脾方组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos蛋白表达显著降低（＜0.01，＜0.05）；与匹维溴铵组比较，温肾健脾方组大鼠结肠组织c-Fos蛋白表达显著降低（＜0.01），背根神经节c-Fos蛋白表达显著升高（＜0.05）。见表4、图4。

表4 各组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos蛋白表达比较（±s）

图4 各组大鼠不同组织中c-Fos蛋白免疫印迹

5 讨论

脑-肠轴是“肠-脑互动”的神经解剖学基础，中枢神经系统和肠神经系统间存在双向联系，从而影响感觉、运动、内分泌、自主神经、免疫功能。一方面，当情绪变化，如焦虑、恐惧，或生理应激时，可以刺激结肠运动功能，表现为结肠收缩加强、诱发排便，甚至出现腹泻症状，同时可以改变内脏敏感性/肠道疼痛阈值，削弱黏膜屏障功能；另一方面，内脏器官炎症和损伤可放大上行内传通路信号，影响脑区活动，引起更明显的疼痛。

IBS-D是较为典型的“肠-脑互动”异常疾病，内脏高敏可能是“肠-脑互动”异常导致的表现之一。机体疼痛阈值降低和/或机体对疼痛信号的放大是形成内脏高敏状态的重要环节。内脏感觉信号经内脏感觉传入神经传递至位于脊髓背根神经节的神经元胞体后交叉至对侧，上行传输至大脑皮层产生内脏感觉。背根神经节所含的初级感觉神经元可以将伤害性刺激转化为动作电位，从外周传递至中枢神经系统，产生伤害性或疼痛信号。反复应激可强化海马区伤害性刺激相关的神经连接。c-Fos属于早期即刻基因，可被第二信使诱导，能对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激引起的传入信息在短时间内作出反应，可作为伤害性神经元激活的标志，是影响突触功能的重要因子。多项研究显示，应激刺激后，大鼠脊髓、延髓孤束核和脑组织c-Fos表达明显增加。据此，基于“肠-脑互动”异常，考虑反复慢性应激可以通过调节突触可塑性影响感觉信号传导，进而改变结肠功能及内脏敏感性。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠Bristol粪便性状评分显著增加，血清D-木糖含量显著减少，各压力水平下AWR评分均显著升高，表明模型组大鼠粪便性状、肠道吸收功能及内脏敏感性均有明显改变。与模型组比较，温肾健脾方组大鼠Bristol粪便性状评分显著降低，血清D-木糖含量显著增加，AWR评分在各压力水平下均显著降低，表明温肾健脾方可以改善IBS-D模型大鼠粪便性状、肠道吸收功能及内脏敏感性。PCR和Western blot结果显示，模型组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos mRNA及蛋白表达显著升高，提示IBS-D模型大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos表达具有一致性，与相关文献结果一致；温肾健脾方组大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos mRNA及蛋白表达显著降低，表明温肾健脾方可以下调IBS-D模型大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos表达。课题组前期研究显示，温肾健脾方可能通过调节IBS-D模型大鼠背根神经节N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体及其磷酸化蛋白表达，调节内脏敏感性。同时相关研究表明，NMDA受体对c-Fos表达有促进作用。因此，本研究表明温肾健脾方通过调节结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos表达，缓解内脏高敏状态，改善肠道吸收功能及粪便性状。

中医认为，肾为先天之本，脾为后天之本，疾病发作日久往往累积于肾，因此，脾肾阳虚是IBS-D发作的关键病机，治以温肾健脾为主，选用《证治准绳》所载四神丸加减化裁。方中补骨脂补肾助阳、温脾止泻，尤善补命门之火以散寒邪；肉豆蔻温补脾肾、涩肠止泻，为治疗虚寒性泻痢之要药；吴茱萸温暖脾胃以散其阴寒之邪；五味子温肾固涩，与吴茱萸相配共奏温涩止泻之功。在此基础上，以太子参、白术健脾益气，郁金清心解郁；姜枣同煮，温补脾胃，鼓舞中焦运化。全方温补并用，通调兼施。现代药理研究表明，太子参多糖可以作用于脑神经元，实现对神经活动的调控作用；白术提取物具有保护神经活性作用，能通过调节γ-氨基丁酸受体发挥抗焦虑作用；郁金提取物可通过降低神经病理性疼痛模型大鼠血清脑源性神经营养因子水平减轻神经病理性疼痛。

综上，本研究表明温肾健脾方能下调IBS-D模型大鼠结肠组织、背根神经节、海马组织c-Fos表达，可能是该方调节内脏高敏性的重要靶点，为该方“脑肠同调”的临床应用提供一定依据。