醒脑解郁方对卒中后抑郁模型大鼠海马神经元形态及凋亡的影响

王豆，李涛，冯亚伦，杨一帆，毛美玲，闫咏梅

1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常见的神经精神并发症，表现为除卒中以外的情绪低落、兴趣下降、思维悲观等抑郁症状，伴有相应躯体症状的综合征。Meta分析表明，三分之一卒中幸存者出现PSD。PSD是功能恢复不良、生活质量不佳和康复结果不理想的主要因素。PSD涉及心理因素、遗传易感性、单胺类递质缺乏、神经营养因子不足、下丘脑-垂体-肾上腺轴失调、神经炎症、突触可塑性损伤、神经元凋亡等。陕西省名中医闫咏梅教授团队创制的醒脑解郁方临床治疗PSD疗效显著。本研究观察醒脑解郁方对PSD模型大鼠海马组织病理形态和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，从海马神经元凋亡方面探讨醒脑解郁方防治PSD的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠72只，成都达硕动物实验公司提供，动物许可证号SCXK（川）2020-030，体质量（200±20）g，饲养于陕西中医药大学中心实验室动物房，自由摄食饮水，适应性喂养1周。

1.2 药物及制备

醒脑解郁方（石菖蒲12 g，远志12 g，丹参30 g，柴胡12 g，合欢皮15 g，姜黄10 g，巴戟天10 g），饮片购自陕西中医药大学附属医院中药房。所有饮片混匀，加10倍量蒸馏水常规煎煮2次，每次30 min，混合2次煎液，浓缩至原药材浓度为1.05、2.1 g/mL，置于4℃冰箱保存备用。盐酸氟西汀胶囊，20 mg/粒，礼来苏州制药有限公司，批号7723A，用蒸馏水配制成浓度为0.208 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

多聚甲醛固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号G1101），DAB显色液（北京中杉金桥生物试剂公司，批号K182720A），中性树胶（西安灏洋，批号LWG-15），HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120），Nissl染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1432），RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白定量检测试剂盒、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶试剂盒、超敏ECL化学发光液（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为14F27C02、14D28C78、14G02A83、14G30C40、14G22C12、14G29C38、14G10A97），PVDF膜（美国Epizyme，批号280679876），Bcl-2抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号BF9103），Bax抗体、β-actin抗体、抗兔二抗、抗鼠二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BM3964、BM0627、MF094、MF093）。TC-120S型组织脱水机（上海寰熙医疗器械），TB-718E型组织包埋机（湖北泰维科技），RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司），DP73型光学显微镜（日本Olympus公司），JXFSTPRP-64型全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司），Micro 17R型冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司），PowerPac Basic凝胶电泳系统、GelDoc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

采用大脑中动脉栓塞（MCAO）联合慢性不可预知温和刺激（CUMS）制备PSD大鼠模型。72只大鼠随机分为假手术组、卒中组、PSD组、氟西汀组和醒脑解郁方低、高剂量组，每组12只。除假手术组外，其余各组采用线栓法制备MCAO模型，大鼠术前禁食禁水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿颈部正中纵向切开皮肤及浅筋膜，钝性分离后，充分暴露并分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及迷走神经，结扎近心端颈总动脉、颈外动脉，于颈内动脉近心端穿线备用，将栓线从颈总动脉分叉处插入颈内动脉，深度约18～22 mm，60 min后撤掉栓线，结扎颈内动脉近心端。假手术组仅暴露并分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及迷走神经，不插入栓线。术后连续3 d肌肉注射青霉素（4万U/只）预防感染。术后24 h采用Longa 5分法对大鼠进行神经功能评定，取评分1～3分大鼠进行后续实验。卒中造模成功后次日，除假手术组、卒中组外，其余各组采用改良CUMS法制备抑郁模型，包括禁食禁水、湿笼、夹尾、强迫游泳、电击、昼夜颠倒、晃笼，每日给予大鼠1种刺激，7种刺激随机进行，相邻2 d刺激不同，连续21 d，造模期间每种刺激共使用3次；同时，氟西汀组予盐酸氟西汀2.08 mg/kg灌胃；醒脑解郁方低、高剂量组分别予10.5、21 g/kg醒脑解郁方药液灌胃（相当于60 kg成人剂量的1、2倍），假手术组、卒中组和PSD组予0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃体积3 mL/只，连续21 d。

2.2 取材

末次给药结束后，各组随机取6只大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，断头取全脑，冰盘上分离海马组织，置于4%多聚甲醛中，4℃固定，用于HE染色和Nissl染色。剩余大鼠麻醉后用150 mL生理盐水进行心脏灌注，迅速取脑，于冰盘上快速分离海马组织，置于-80℃冰箱冻存，用于Western blot检测。

2.3 一般状况观察

每日观察并记录大鼠精神状态、自主活动、毛色、进食、饮水、粪便情况。

2.4 神经功能缺损评分

给药结束后即刻，按照Longa 5分法对大鼠进行神经功能缺损评分。0分，无神经缺损；1分，肢体瘫痪侧前爪舒展不完全；2分，行走时向肢体瘫痪侧转圈；3分，行走时向肢体偏瘫侧倾斜；4分，丧失自发行走能力，存在意识丧失现象。

2.5 海马组织病理观察

取4%多聚甲醛固定的海马组织，经脱水、透明、常规石蜡包埋，切片，行HE、Nissl染色，显微镜下观察海马组织形态变化。

2.6 Western blot检测

取100 mg海马测组织，按1∶10加入裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂），冰上裂解30 min，超声匀浆，12000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA法检测蛋白浓度。加入5×蛋白上样缓冲液，100℃煮5 min。按30 μg蛋白/孔道上样，SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF膜，加5%脱脂牛奶，室温封闭1 h。TBST洗膜，加入Bcl-2一抗（1∶1000）、Bax一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶2000），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，滴加二抗（1∶5000），室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。超敏ECL试剂曝光，凝胶成像系统观察并拍照。利用Image J 2.0软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 醒脑解郁方对模型大鼠一般状况的影响

卒中组大鼠精神萎靡，活动尚可，形体较瘦弱，毛色少光泽，毛量减少，饮食与粪便尚可；PSD组大鼠精神萎靡，活动性差，形体消瘦，毛色枯黄，毛量减少，饮食减少，粪便量较少、偶有稀溏；氟西汀组及醒脑解郁方低、高剂量组大鼠精神状态尚可，活动量增加，毛色有光泽，毛量增多，饮食增多，粪便正常。

4.2 醒脑解郁方对模型大鼠神经功能缺损评分的影响

与假手术组比较，卒中组和PSD组大鼠神经功能缺损评分明显升高（＜0.01）；与PSD组比较，氟西汀组及醒脑解郁方低、高剂量组大鼠神经功能缺损评分明显降低（＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（±s，每组12只）

4.3 醒脑解郁方对模型大鼠海马组织病理形态的影响

假手术组大鼠海马组织神经细胞形态完整、排列密集，胞浆染色均匀，核仁清晰，细胞间隙无水肿，尼氏体丰富，未见明显坏死、炎性细胞浸润等病理改变；卒中组和PSD组大鼠海马组织可见部分细胞结构模糊、排列紊乱、数量减少，胞核固缩，尼氏体数量减少，坏死灶边缘有炎性细胞浸润；氟西汀组及醒脑解郁方低、高剂量组大鼠海马组织神经细胞结构较完整，细胞数量较多，排列较为紧密、整齐，尼氏体较丰富。见图2、图3。

图2 各组大鼠海马组织形态（HE染色，×400）

图3 各组大鼠海马组织形态（Nissl染色，×400）

4.4 醒脑解郁方对模型大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值的影响

与假手术组比较，卒中组和PSD组大鼠海马组织Bax蛋白表达明显升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低（＜0.01）；与PSD组比较，氟西汀组及醒脑解郁方低、高剂量组大鼠海马组织Bax蛋白表达明显降低（＜0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高（＜0.01）。见图4、表1。

图4 各组大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白免疫印迹

表1 各组大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值比较（±s）

5 讨论

根据PSD症状，可归属于中医学“中风”“郁证”范畴。依据发病次序，为“中风后郁证”，但多从“郁证”论治。西医学认为PSD是抑郁的一种特殊类型。《CCMD-3中国精神障碍分类与诊断标准（第二版）》将其归入“脑血管病所致精神障碍”。此外，PSD的临床表现具有复杂性、多样性，除具备卒中本身的神经功能损伤症状外，还有核心和非核心症状之分。其中核心症状为抑郁、兴趣减退、易疲劳，严重者有自杀倾向。非核心症状以体质量下降、睡眠障碍、不明原因疼痛、食欲减退或亢进、性欲减退等生理症状为主，可伴有注意力下降、紧张不安、焦虑、运动性激越、自责、自罪等。

PSD发生的机制和学说主要包括遗传机制、社会心理学说、生物学机制等。PSD的遗传机制与个人、家族史、基因等有关。社会心理学说即生物-心理-社会模式，卒中后患者日常生活质量下降，疾病负担沉重，家庭及社会环境改变，致患者心理应激障碍，心理平衡失调，导致PSD发生。PSD作为一种器质性情感障碍，其神经生物学基础主要是5-羟色胺、去甲肾上腺素及多巴胺等单胺类递质失衡，神经营养因子不足，下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常，机体肠道菌群紊乱，中枢神经系统炎症因子水平升高，海马、杏仁核、额叶皮质等部位神经突触可塑性损伤，细胞自噬与凋亡等。其中神经细胞凋亡在PSD的发病过程中存在持续作用，被认为与PSD等并发症的发生发展关系密切。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，生理情况下有益于机体代谢，病理状态下则造成组织损伤。卒中后缺血、缺氧导致脑内自由基、谷氨酸、炎症因子等异常增多，产生细胞毒性作用，进而损伤神经元及突触可塑性，诱导神经细胞凋亡，影响卒中恢复或导致抑郁等合并症。线粒体凋亡途径是细胞凋亡的关键环节，Bcl-2蛋白是重要的抗凋亡蛋白，Bax是主要的促凋亡蛋白。Bcl-2/Bax比值可直接反映细胞凋亡状态，Bcl-2/Bax比值降低提示促进凋亡，升高则细胞凋亡被抑制。已有研究显示，抑制凋亡可明显改善神经功能，改善抑郁症状。临床研究显示，PSD患者血清Bax、Caspase-3等凋亡因子表达显著升高，药物逆转凋亡蛋白表达后，抑郁症状明显改善。动物实验发现，PSD模型大鼠海马组织Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达下降。部分抗抑郁药物可调节海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达，改善PSD大鼠抑郁状态，可能与促进脑源性神经营养因子（BDNF）表达有关。课题组前期动物实验发现，醒脑解郁方可通过BDNF/ERK/CREB通路和降低促炎因子表达改善PSD模型大鼠抑郁状态，发挥明显抗抑郁作用。因此，本研究进一步探讨醒脑解郁方对PSD模型大鼠海马组织凋亡相关蛋白表达的影响。结果表明，醒脑解郁方可通过上调海马组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，升高Bcl-2/Bax比值，发挥抗PSD作用。

PSD与海马区神经元萎缩密切相关。影像学研究发现，重度抑郁患者大脑海马体积有不同程度缩小，突触数量亦有所减少。动物模型可见海马超微结构改变，包括海马树突萎缩、神经元增殖减少。慢性应激诱导的抑郁动物模型还可观察到海马区神经元、胶质细胞均出现萎缩和缺失现象，且上述改变在应用抗抑郁药物后可逆转。相较于单纯中风患者，PSD患者日常生活质量明显下降，尤其在认知、情感、肢体功能及社会功能等领域。中风后神经元损伤或凋亡是PSD不良预后的重要原因。减轻神经元损伤，保护神经元存活，促进神经元修复和再生可能是预防和治疗PSD的重要手段。当神经元受损时，尼氏体发生溶解和消失。本实验发现，PSD模型大鼠海马神经元数量减少、排列紊乱，胞核皱缩、溶解、碎裂，胞浆浓缩，细胞间隙变大，尼氏体数量减少；醒脑解郁方治疗后，大鼠海马组织神经细胞结构较完整，细胞数量较多，形态呈圆形或椭圆形，排列较为紧密、整齐，尼氏体较丰富，表明醒脑解郁方可减轻和修复神经元损伤。

PSD临床治疗以抗抑郁药物为主，虽具有不同程度疗效，然而存在肝肾毒性、撤药综合征，增加心脑血管疾病风险等，限制临床应用。闫咏梅教授将PSD的核心病机概括为痰瘀交阻、气郁不畅、正气亏虚，创制醒脑解郁方，临床应用数十年，疗效显著。醒脑解郁方由石菖蒲、远志、丹参、柴胡、合欢皮、姜黄和巴戟天组成。药理研究表明，石菖蒲超临界萃取物可改善大鼠抑郁样行为，其主要成分β-细辛醚可通过调节神经元存活发挥抗抑郁作用；远志活性部位YZ-50可抑制神经细胞损伤和凋亡，发挥抗抑郁作用；丹参酮可保护脑缺血引起的神经元损伤及凋亡；柴胡皂苷A可通过促进海马区BDNF表达，减少神经细胞凋亡，发挥抗抑郁作用。

综上，醒脑解郁方可通过改善海马神经元形态，促进海马组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达，增加Bcl-2/Bax比值，发挥抗PSD作用。