热补针法对类风湿关节炎寒证模型兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT表达的影响

袁博，张枫帆，张星华，姚小强，井维尧，杜小正

1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵犯小关节为主的免疫系统疾病，常呈对称侵袭，主要涉及关节滑膜、关节软骨损伤，并伴有皮肤、血管和内脏器官损害。数据显示，全球约1%人口患RA，发病率高，疾病后期出现关节畸形、功能丧失，严重损害患者的身心健康与生存质量。RA发病机制尚未完全阐明。研究显示，氧化应激在RA发生发展中发挥重要作用，沉默信息调节因子3（SIRT3）通过介导活性氧（ROS）清除参与RA发病。SIRT3与超氧化物歧化酶（SOD）2和过氧化氢酶（CAT）等ROS清除酶的活性及表达关系密切，调控SIRT3的表达能调节ROS清除酶的活性，从而发挥抗氧化作用。热补针法是郑魁山教授临床治疗RA的经验法，具有补益正气、温阳散寒作用，由“烧山火”“进火法”简化改良而成，临床治疗阳虚致寒痹证疗效较好。课题组前期研究表明，热补针法对RA模型兔具有相对特异性干预作用。基于此，本研究以RA寒证模型兔为研究对象，观察热补针法对兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT表达的影响，进一步探讨其干预RA的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

30只健康普通级雄性新西兰兔，2～3月龄，体质量（2.5±0.5）kg，购于兰州大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2013-0002。饲养于温度（20±2）℃、相对湿度（50±10）%环境，室内采光、通风均良好，适应性饲养7 d。

1.2 主要试剂与仪器

DEPC水（货号7732-185，德国Sigma公司），弗氏完全佐剂（FCA，货号F5881，德国Sigma公司），卵蛋白干粉（货号A5253-250G，德Sigma公司），TRIeasyTotal RNA Extraction Reagent（货 号T0817211，上海翌圣生物），HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（货号T081721，上海翌圣生物），HieffqPCR SYBR Green Master Mix（货号10606ES60，上海翌圣生物）。华成牌一次性针灸针（0.22 mm×25 mm，北京珞亚山川医疗器械有限公司），热刺痛仪（型号PL-200，成都泰盟软件有限公司），彩色超声诊断仪（型号8～12 MHz，德国百盛公司），超微量分光光度计（型号NanoDrop One，美国Thermo公司），实时定量PCR仪（型号StepOne Plus，美国Agilent公司）。

1.3 造模及分组

30只兔采用随机数字表法选取6只作为正常组，剩余24只采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制RA寒证模型。实验前3 d，剪去肩胛区兔毛，于肩背部均匀选取6个点，2%碘酒、75%酒精消毒，每点注射0.2 mL乳化剂（4 mg/mL卵蛋白溶液与等量FCA混合，充分震荡）。14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次。6 d后清理兔双侧后腿膝关节体毛，用2%碘酒、75%酒精消毒，定位膝关节腔，注入20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL，24 h内膝关节即出现红肿触痛。造模后第2日，2%碘酒、75%酒精消毒后腿膝关节，四周予冷冻处理，采用冰袋围置冷冻1.5 h、45℃温水复温5 min，每日1次，共14 d。造模兔出现精神萎靡，身体蜷缩，膝关节肿胀、局部青紫、周径明显变大、皮温不高，两后肢匍匐跛行，触之有躲避行为，表示成功建立RA寒证模型。将24只成模兔随机分为模型组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组，每组6只。

1.4 干预

正常组、模型组不予干预，只做与各针刺组相同的抓取、固定；各针刺组将兔固定，2%碘酒、75%酒精消毒，毫针90°（深度8～12 mm）直刺双侧“足三里”。平补平泻组：予平补平泻法针刺。针刺得气后，前后均匀捻转针体，防止单向捻转，指力均匀适中，角度控制在180°～360°，频率60～90 r/min。捻转补法组：予捻转补法针刺。针刺得气后，小幅度前后捻转针体，角度控制在180°～360°，频率60～90 r/min，拇指向前转动时用力重，指力沉重向下，拇指向后还原转动时用力轻。热补针法组：予热补针法针刺。针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次，针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次，拇指再向前连续捻按5次。各针刺组行针1 min，留针30 min，每日1次，连续7 d。各针刺组手法操作均统一培训，并由同一人完成。

1.5 检测指标

1.5.1 一般观察

观察兔精神状态、饮食饮水、反应能力、活动情况及关节肿胀情况等。

1.5.2 痛阈检测

针刺结束后，采用PL-200热刺痛仪刺激兔膝关节测痛点，从刺激开始到兔出现挣扎躲避所用时间即为痛阈，共测量3次，取平均值。

1.5.3 彩超观察

使用线阵探头为8～12 MHz的彩色多普勒超声诊断仪检查兔膝关节，针对膝关节腔附近多角度采集图像，观察膝关节腔积液、滑膜厚度及血流信号。

1.5.4 HE染色

采用空气栓塞法处死兔，完整剥离膝关节滑膜组织，置于10%福尔马林溶液中固定，从固定液中取出滑膜组织（厚约0.5 cm），石蜡包埋，切片（约5 μm），常规HE染色。镜下观察滑膜被覆细胞、炎性细胞、滑膜基质等情况。

1.5.5 RT-PCR检测

提取膝关节滑膜组织总RNA，室温放置10 min，根据沉淀量加入适量DEPC水，超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度，将RNA反转录为cDNA，进行PCR。反应条件：25℃、5 min，42℃、30 min，85℃、5 min，85℃、5 min，1个循环；95℃预变性5 min，1个循环；95℃变性10 s，60℃退火30 s，40个循环；60～95℃缓慢加温。建立熔解曲线。根据目的基因与内参基因Ct值，并用内参进行标准化处理，依据2法对mRNA表达进行相对定量分析。SIRT3、SOD2、CAT及内参rab-actb引物由宝生物工程（大连）有限公司设计合成（见表1）。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般状况

正常组兔精神状态良好，模型组兔精神萎靡，体毛杂乱，膝关节肿胀，触之挣扎躲避，活动量减少，饮食减少，各针刺组兔精神状态较模型有所好转，饮食增加，关节肿胀度减轻，热补针法组改善更明显。

2.2 热补针法对模型兔关节痛阈的影响

与正常组比较，模型组兔痛阈明显降低（＜0.05）；与模型组比较，各针刺组兔痛阈明显升高（＜0.05）；与平补平泻组、捻转补法组比较，热补针法组兔痛阈明显升高（＜0.05）。见图1。

图1 各组兔膝关节痛阈比较（±s，每组6只）

2.3 热补针法对模型兔膝关节彩超结果的影响

正常组兔膝关节滑膜厚度无异常，滑膜内未见异常血流信号，无积液；模型组兔膝关节滑膜增厚明显，滑膜内呈网状及树枝状血流信号，有大量积液，范围广泛，可见关节肿胀；平补平泻组、捻转补法组兔膝关节滑膜略增厚，滑膜内血流信号呈点状或点线状，积液减少，关节肿胀减轻；热补针法组兔膝关节滑膜增厚不明显，滑膜内有少量点状血流信号，微量积液或无积液。见图2。

图2 各组兔膝关节彩超表现

2.4 热补针法对模型兔膝关节滑膜组织病理形态的影响

正常组兔膝关节滑膜被覆细胞排列整齐，滑膜基质未见异常，无炎性细胞浸润；模型组兔膝关节滑膜被覆细胞肿大明显、排列紊乱，滑膜基质重度增生，炎性细胞重度浸润；各针刺组兔膝关节滑膜被覆细胞情况、滑膜基质状态、炎性细胞浸润均有改善，热补针法组效果最明显。见图3。

图3 各组兔膝关节滑膜组织形态（HE染色，×100）

2.5 热补针法对模型兔膝关节滑膜组织沉默信息调节因子3、超氧化物歧化酶2和过氧化氢酶mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT mRNA表达明显升高（＜0.05）；与模型组比较，平补平泻组、捻转补法组和热补针法组兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT mRNA表达明显降低（＜0.05）；与平补平泻组、捻转补法组比较，热补针法组兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT mRNA表达明显降低（＜0.05）。见表2。

表2 各组兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT mRNA表达比较（±s）

3 讨论

RA主要表现为关节肿痛，慢性疼痛影响患者生活质量，是临床治疗亟需解决的问题。本实验结果表明，各针刺组痛阈较模型组明显升高（＜0.05），证实针刺具有明显的镇痛效应，其中热补针法组痛阈升高更明显（＜0.05），提示热补针法镇痛作用具有相对特异性，与课题组前期研究结果一致。

彩色多普勒超声及病理形态观察对RA早期诊断和检测意义重大。在RA发病中，滑膜厚度与异常血流信号关系密切。本实验彩超观察结果显示，各针刺组滑膜厚度、积液、异常血流信号、滑膜被覆细胞情况、滑膜基质状态、炎症细胞浸润均明显改善，热补针法组改善更明显，证实热补针法可减轻RA兔膝关节滑膜厚度，改善异常血流信号及炎性细胞浸润，发挥其相对特异性抗炎作用。

针灸治疗RA疗效显著。平补平泻是临床应用最普遍的手法，捻转补法具有温补之功，符合针灸临床虚证用针刺补法的规律，因此选择二者作对照研究。热补针法功效与RA寒证病因病机特点相吻合。课题组前期研究显示，热补针法对RA模型兔具有治疗作用，可相对特异性发挥镇痛作用及调节能量代谢障碍。此外，针刺通过提高抗氧化酶活性，发挥抗氧化应激作用。热补针法能提高RA患者血浆谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提示热补针法具有抗氧化应激作用。SIRT3是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，主要通过提高抗氧化酶活性，增强线粒体内ROS清除作用，发挥抗氧化应激作用。研究显示，SIRT3能通过其去乙酰化活性作用于病理过程的关键靶点和蛋白，对细胞内ATP产生影响，调节氧化代谢。SODs是抗氧化系统中最重要也是最原始的抗氧化酶，当SIRT3过表达时可上调SOD2和CAT表达。本实验结果显示，各针刺组兔膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT mRNA表达均明显降低（0.05），热补针法组降低更明显（＜0.05），SIRT3、CAT、SOD2 mRNA水平变化反映RA模型兔体内的氧化应激水平，证实热补针法可增强RA模型兔抗氧化能力，改善机体氧化应激水平。

综上所述，热补针法能改善RA寒证模型兔一般状况，提高痛阈，减轻膝关节滑膜厚度，改善异常血流信号及炎性细胞浸润，下调膝关节滑膜组织SIRT3、SOD2、CAT表达，提示热补针法干预RA的相对特异性与调控氧化应激反应有关。