1例Rh(D--)表型的临床及分子生物学研究

张 知，王长奇，叶水文，高宏军，付国昌，王 康△

1.江西省赣州市立医院检验科，江西赣州 341000;2.江西省临川嘉德第三医院检验科，江西抚州 344100；3.南昌大学第二附属医院中西结合科，江西南昌 330006；4.江苏省诺贝尔奖得主蒂姆亨特研究院输血医学研究中心，江苏无锡214400

近10年，Rh血型系统的研究取得了丰硕成果和较大进展，积累了大量分子生物学的研究资料，但是各种RHCE变异型形成的原因及其临床意义，Rh抗体产生的机制及意义等未知的领域有待进一步研究[1]。

近来作者在老年人中发现1例D为阳性、CcEe不表达的DC-c-E-e-(或者D--)表型患者，案例较为罕见。通过基因检测，证实为RHCE*Ce/RHCE*Ce基因型。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，男，82岁，江西抚州人，由于反复咳嗽，加重1 d而入院。

1.2仪器与试剂 试剂：ABO/RhD血型定型检测试剂卡(批号：202107003)、Rh血型分型检测卡(批号：202106033)、抗人球蛋白(抗IgG)检测卡(批号：202012022)均由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供；人类红细胞RHCE血型基因分型试剂盒(荧光PCR法)(批号：20210401)、RHCE外显子(科研)测序试剂盒(批号：20210401)均由江苏中济万泰生物医药有限公司提供；血液基因组DNA提取试剂盒(杭州博日公司)等。仪器：LB-3000血型卡离心机、LB-C02-1试剂卡孵育器均由无锡源博生物科技有限公司提供；离心机(日本久保田公司)；荧光定量PCR仪(杭州博日公司)；ABI 3730型基因分析仪(美国AB公司)。

1.3方法

1.3.1血常规检测 按《全国临床检验操作规程》在医院进行检测。

1.3.2血清学试验

1.3.2.1ABO血型正反定型及RhD定型实验 按照ABO/RhD血型定型检测试剂卡的说明书操作步骤，进行ABO血型正定型、反定型及RhD血型定型。

1.3.2.2Rh血型定型实验 按照 Rh血型分型检测卡的说明书操作步骤，进行Rh血型系统的C、c、D、E、e抗原的检测。

1.3.2.3不规则抗体测定 按照抗人球蛋白(抗IgG)检测卡的说明书操作步骤进行抗体测定。

1.3.3分子生物学实验

1.3.3.1血液基因组DNA的提取 按照血液基因组DNA提取试剂盒的说明书操作步骤提取基因组DNA。

1.3.3.2RHCE基因荧光分型 按照人类红细胞RHCE血型基因分型试剂盒(荧光PCR法)的说明书操作步骤进行基因分型。

1.3.3.3RHCE基因外显子测序 按照RHCE外显子(科研)测序试剂盒的说明书操作步骤进行基因测序。测序结果与GenBank中RHCE基因的标准序列进行比对分析。

2 结 果

2.1血常规检测 白细胞总数14.22×109/L，嗜中性粒细胞比例78.21%，淋巴细胞比例14.81%，单核细胞比例6.28%，嗜碱性粒细胞比例0.08%，嗜酸性粒细胞比例0.62%。

2.2血清学鉴定结果 ABO/RhD 血型抗原检测中发现，患者ABO血型为O型，RhD 血型检查为 D 阳性；Rh 血型分型鉴定D为阳性，CcEe均不表达；不规则抗体测定，结果均为阴性。

2.3RHCE基因序列分析 经序列测定和参考序列比对分析发现，WK712和WK713位于 RHCE基因第1外显子编码区的48位碱基由G突变为C(c.48G>C)，为纯合突变；第2外显子编码区150位碱基由C突变为T(c.150C>T)、178位碱基由C突变为A(c.178C>A)、201位碱基由A突变为G(c.201A>C)、203位碱基由A突变为G(c.203A>G)、307位碱基由C突变为T(c.307C>T)，所有突变点均为纯合突变。确定患者的RHCE基因型为 RHCE*Ce/RHCE*Ce 。测序结果见图1。

图1 患者外显子1、2测序结果图

3 讨 论

本例患者外表正常，出生时并无双胞胎，无输血史和干细胞移植史，由于反复咳嗽，加重1 d支气管肺炎而入院，无贫血病史。在医院检查中，Rh血型分型为 D 阳性，CcEe不表达；患者不规则抗体测定结果为阴性；RHCE 基因荧光分型为 CCee。 根据 ZHAO 等[2]报道的体系扩增 RHCE 基因 10 个外显子片段，测序分析，该标本 RHCE 基因型符合RHCE*Ce/RHCE*Ce。本例患者与其他报道[3-5]有差异，导致 RhCE 抗原不表达的原因有待进一步探讨。

国内对 CcEe 表型的研究，RhD(+) 个体>90%是 CCee、CcEe 和 Ccee 表型，其中以 CCee 最多，占 51.82%[6]；本例患者表型是 CCee。Rh血型是一种较为复杂的血型系统，Rh抗原能引起严重的免疫反应和新生儿溶血病。2000年原卫生部发布的《临床输血技术规范》明确要求检测RhD抗原，但未规定检测CcEe抗原。然而，当供者与受者CcEe抗原表型不合进行输血时常会导致相应同种抗体的产生。本例患者没有输血；如果病情需要进行临床输血，且不检测CcEe 抗原进行配合输注，很可能发生输血反应，不利于患者康复。因此作者认为如果能针对特殊个例进行Rh 5项全面检测，条件成熟时建立和完善我国 D--稀有血型库，对发生意外需要临床输血的患者会很有助益。尤其是对于有长期输血需求的患者，CcEe抗原全部相合最为安全。

本例D--与RHCE基因异常有关，也存在基因变异体并形成CcEe 抗原变异体，这些变异体可导致血清学抗原鉴定或基因分型出现一些假阳性或假阴性[7-8]。本例CcEe 抗原的变异体无表达，常规检测方法难以准确定型，可能导致同种免疫的发生，这样患者日后输血会面临更大风险。应用RHCE 基因分型配合血清学分型技术，研究 RHCE 基因的多态性以及造成抗原表型多样性，对于提高血清学检测及分子定型的准确性，减少临床输血反应意义较大。

本例D--表型，经过RHCE基因检测发现RHCE基因突变并不是该表型产生的分子机制。从检测结果看，荧光分型和测序结果都判定为样本基因型为RHCE*Ce/RHCE*Ce，血型理论上是CCee，但血清学试验是C-c-E-e-。此种现象相当罕见，需要寻找其他分子机制解释，下一步拟对标本进行家系调查。它的发现对我们进一步研究人类遗传性疾病发生的分子基础提供了宝贵的素材。相信经过广大医学工作者的努力，这一领域的研究一定会取得突破性进展。