野鸢尾黄素对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

毕彩云，夏 岩

陕西省西安市北方医院妇科，陕西西安 710000

目前，卵巢癌的标准治疗方法是手术后联合化疗，但因缺乏前期筛查试验及存在很高的复发率，仍然是最致命的妇科癌症[1-3]，因此，寻找新的治疗策略，抑制其复发显得尤为重要。据报道，中药在肿瘤的治疗中具有改善患者生存质量、降低转移复发率等优势。野鸢尾黄素是一种从中药提取的活性黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤活性。基于此，本研究拟研究野鸢尾黄素对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的调节机制。

1 材料与方法

1.1材料来源 人卵巢癌SKOV3细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；FBS、RPMI-1640培养基、青链霉素均购自美国HyClone公司；胰岛素购自美国Sigma公司；野鸢尾黄素购自美国MCE公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin抗体购自美国Proteintech公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人卵巢癌SKOV3细胞采用RPMI-1640完全培养基于37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到85%～95%时进行传代及实验。

1.2.2CCK-8实验测定SKOV3细胞活力 实验设定为6组，取处于对数生长期，生长状态良好的SKOV3细胞以5×103个/100 μL，接入96孔板，37 ℃培养过夜；贴壁后加入不同水平(0、10、25、50、100、200 μmol/L)的野鸢尾黄素处理48 h，每孔加入10 μL CCK-8孵育30 min，并于酶标仪450 nm处测定其吸光度，根据吸光度计算不同浓度处理组SKOV3细胞活力。

1.2.3细胞分组与给药方法 根据上述CCK-8实验结果，将实验分为对照组、低剂量组、高剂量组。对照组不加任何药物，选择加野鸢尾黄素后使SKOV3细胞的增殖能力下降1/3、2/3左右的两个浓度为低剂量组、高剂量组浓度，处理48 h。

1.2.4细胞侵袭 制备浓度为2×104/mL的各组人卵巢癌SKOV3细胞无血清细胞悬液。24孔板底部加800 μL RPMI-1640完全培养基，Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL 1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel干成胶状后在Transwell上室分别加入200 μL各组细胞悬液，5%CO2、37 ℃培养箱培养24 h。取出Transwell小室，PBS清洗一侧未侵袭细胞，并用10%甲醇溶液固定30 min。切下膜并在膜上滴1滴5%结晶紫染液，静置染色20 min，PBS清洗后于显微镜(×40)下观察拍照。实验重复3次。

1.2.5细胞划痕实验 Marker笔在6孔板背后划线，将人卵巢癌细胞SKOV3单细胞悬液(约2×105个)均匀接种到6孔板中培养过夜。第2天用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕。PBS清洗后加入无血清培养基、拍照，并于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后再次拍照，计算迁移距离。

1.2.6采用免疫印迹实验检测E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白的表达 各组人卵巢癌SKOV3细胞经冰冻PBS洗涤，在蛋白裂解缓冲液中提取，用Bradford法测定蛋白浓度后，变性并电泳分离。电泳后，蛋白质转移到PVDF膜并于4 ℃过夜孵育内参GAPDH及E-cadherin(1∶100)、N-cadherin(1∶100)、β-catenin(1∶100)一抗。洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h，并用ECL化学发光系统观察信号，计算目的蛋白相对于GAPDH的表达量，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 结 果

2.1野鸢尾黄素对SKOV3细胞活性的影响 CCK-8实验检测野鸢尾黄素处理的SKOV3细胞活性，结果显示野鸢尾黄素处理48 h后各剂量处理组(0、10、25、50、100、200 μmol/L)细胞活力分别是(100.0±4.0)%、(90.6±2.6)%、(71.2±3.7)%、(62.6±2.6)%、(31.8±6.3)%、(18.8±6.6)%，其他剂量处理组的SKOV3细胞活性与0 μmol/L组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图1。这提示野鸢尾黄素可抑制SKOV3细胞的增殖，基于野鸢尾黄素浓度为50、100 μmol/L处理时，细胞的增殖能力下降1/3、2/3左右，所以选择50 μmol/L(低剂量组)、100 μmol/L(高剂量组)进行后续的实验。

注：与0 μmol/L组相比，*P<0.01。

2.2野鸢尾黄素对SKOV3细胞侵袭的影响 细胞侵袭实验显示，对照组、低剂量组、高剂量组侵袭的SKOV3细胞数量分别是(104.00±3.33)个、(83.00±3.33)个、(51.00±2.66)个，与对照组相比，低剂量组、高剂量组SKOV3细胞的侵袭能力均下降 (P<0.01)。见图2。

图2 Transwell小室实验检测野鸢尾黄素对SKOV3细胞侵袭能力的影响(×40)

2.3野鸢尾黄素对SKOV3细胞迁移的影响 细胞迁移实验显示，对照组、低剂量组、高剂量组SKOV3细胞24 h迁移的距离分别是(336±7)μm、(170±17)μm、(76±5)μm，与对照组相比，低剂量组、高剂量组SKOV3细胞的迁移能力均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图3 细胞划痕实验检测野鸢尾黄素对SKOV3细胞迁移能力的影响

2.4野鸢尾黄素对SKOV3细胞E-cadherin、N-cadherin表达的影响 对照组、低剂量组、高剂量组E-cadherin蛋白水平分别为0.24±0.05、0.52±0.06、0.64±0.06，N-cadherin蛋白水平分别为0.53±0.06、0.30±0.06、0.22±0.05。与对照组相比，低剂量组、高剂量组细胞的E-cadherin蛋白表达均上升，N-cadherin蛋白表达均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 免疫印迹实验检测野鸢尾黄素对SKOV3细胞E-cadherin、N-cadherin表达的影响

2.5野鸢尾黄素对SKOV3细胞β-catenin蛋白的影响 采用免疫印迹实验检测SKOV3细胞β-catenin蛋白的表达，结果显示对照组、低剂量组、高剂量组β-catenin蛋白的水平分别为0.47±0.06、0.35±0.06、0.31±0.05，与对照组相比，低剂量组、高剂量组SKOV3细胞的β-catenin蛋白表达均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 免疫印迹实验检测野鸢尾黄素对SKOV3细胞β-catenin蛋白表达的影响

3 讨 论

卵巢癌是对女性健康影响最大的恶性肿瘤之一，虽然传统的治疗策略在一定程度上提高了卵巢癌患者的总生存率，但是肿瘤的侵袭、转移、复发等恶性表型特征使得其病死率居高不下[1-3]。

野鸢尾黄素是一类从植物中提取的多酚类化合物，其结构与内源性雌激素相似，已被证实具有多种生物活性并被应用于多种疾病的治疗[4-10]。ZENG等[9]研究表明野鸢尾黄素通过下调蛋白激酶B(AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路以及上调Caspase家族的表达和(或)活性来抑制人乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移。YEH等[11]研究表明野鸢尾黄素通过G0/G1期细胞周期阻滞抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。GUO等[12]研究表明，野鸢尾黄素对骨肉瘤细胞(Saos2和U2OS)的增殖具有一定的抑制作用，且具有剂量依赖性和时间依赖性，同时显著抑制OS细胞的迁移和侵袭，上调Cleaved Caspase 3的表达，下调MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达，从而发挥对骨肉瘤细胞的调节作用。由此推测野鸢尾黄素可能对卵巢癌发挥抑制作用，本研究中采用CCK-8实验检测野鸢尾黄素对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响，结果显示野鸢尾黄素抑制SKOV3细胞的增殖并表现出浓度依赖性，同时野鸢尾黄素的加入抑制了SKOV3细胞的侵袭、迁移。

EMT在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，EMT促进癌症转移和复发[13-15]。为了评估野鸢尾黄素对SKOV3细胞迁移和侵袭的抑制作用是否与EMT相关，采用免疫印迹实验检测EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin)的表达，结果显示野鸢尾黄素增加了E-cadherin的表达，降低了N-cadherin的水平。

Wnt/β-catenin信号通路已被证明有助于EMT的转移，同时Wnt/β-catenin通路在卵巢癌的进程中发挥重要调节作用[16]。因此，为了进一步验证野鸢尾黄素抑制EMT的过程与Wnt/β-catenin信号通路相关，本研究采用免疫印迹实验检测Wnt/β-catenin信号通路的核心分子β-catenin的表达，结果显示野鸢尾黄素可抑制β-catenin的表达。

综上所述，本研究观察了野鸢尾黄素对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移能力，以及E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白表达的影响，结果显示野鸢尾黄素可能通过抑制β-catenin蛋白的表达，从而抑制SKOV3细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT。