Box-Behnken响应面法优化穿山龙总皂苷的提取工艺及体外抗氧化活性研究

范晓阳，贾世艳，司瑞花，郑博文，刘光珍✉

（1.山西省中医药研究院，山西 太原 030012；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619）

穿山龙是薯蓣植物穿龙薯蓣的干燥根茎［1］，味甘、苦，性温，归肺、肾和肝经。穿山龙中主要活性成分是甾体皂苷类化合物，主要包括纤细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷等，此外还有黄酮类和菲醌类化合物，目前已经从穿山龙中分离出20多种化合物［2-3］，如薯蓣皂苷、苯甲酸等。穿山龙总皂苷具有保肝、抗炎、免疫调节、降尿酸、抗肿瘤和肾病治疗作用等多种生物学活性［4-9］，且目前已被用作合成治疗冠心病的甾体激素和皂苷类药物的重要工业原料［10］。目前的研究表明，穿山龙是抗氧化化合物的良好来源。显示出最高活性的组分可进一步分离出用于治疗相关疾病的新型、经济有效和更安全的活性化合物。

本实验以穿山龙为材料，对超声辅助提取工艺进行优化，在单因素实验的基础上，选择乙醇浓度、提取时间、提取温度、超声时间为自变量，以总皂苷的提取率为指标，采用响应面法优化得到穿山龙总皂苷的超声提取最佳工艺。同时采用非极性的AB-8 大孔吸附树脂对穿龙山总皂苷进行纯化，最后考察了总皂苷纯化前后的体外抗氧化活性，为穿山龙的进一步开发利用提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

穿山龙饮片（山西省中医药研究院提供，经刘光珍教授鉴定为正品）；薯蓣皂苷（中国食品药品检定研究院，批号：20210526，纯度：≥98%）。

高氯酸（分析纯，批号：06127635412，天津市申泰化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，批号：20196745198，天津市申泰化学试剂有限公司）、香草醛（分析纯，批号：06712987156，天津市申泰化学试剂有限公司）；维生素C（VC）溶液（批号：060721210618，上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

754 型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DACW-4恒温水浴锅（广州中兴实验仪器有限公司）；FW-100 万能粉碎机（上海比朗仪器制造）；GZX-ME-Ⅱ电热恒温干燥箱（上海发展医疗器械有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 穿山龙总皂苷的提取工艺流程

穿山龙总皂苷先经过粉碎、过筛（40 目），再进行石油醚回流脱脂，干燥备用。脱脂后的穿山龙粉末先经过超声辅助提取，后再进行乙醇回流提取，浓缩液干燥，得到穿山龙总皂苷粗品［11-12］。

1.3.2 总皂苷的含量测定

1.3.2.1 标准溶液的配制

精密称定薯蓣皂苷对照品4.00 mg，加甲醇溶解定容至25 mL 容量瓶中，超声15 min，即得浓度为0.16 mg/mL的薯蓣皂苷标准溶液，备用。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

取上述配制好的标准溶液，分别精确吸取0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mL 于磨口具塞试管中，70 ℃水浴蒸发溶剂，依次加入新配制的5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，70 ℃水浴充分反应20 min，取出，冰水冷却5 min，加冰醋酸至10 mL，摇匀，静置20 min，在波长370 nm 处测吸光度值。以薯蓣皂苷的标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：

Y=23.731X-0.273 3，R2=0.997 6，Y 为吸光度，X 为薯蓣皂苷浓度（mg/mL），线性范围为0.016～0.320 mg/mL。

1.3.2.3 穿山龙总皂苷的含量测定

取上述提取的总皂苷粗品，用甲醇溶解，配制成浓度为0.16 mg/mL的溶液，吸取1 mL样品溶液于具塞试管中，用甲醇做对照，根据“1.3.2.2”项下标准曲线绘制的方法测定吸光度。依据标准曲线计算出总皂苷浓度，并根据公式（1）计算出样品总皂苷的含量［13］。

其中，d为稀释倍数，C为根据标准曲线计算溶液中总皂苷的质量浓度（mg/mL），M为称取的样品质量（mg），V为定容体积（mL）。

1.3.3 穿山龙总皂苷的提取工艺优化

1.3.3.1 单因素实验

取上述预处理过的穿山龙粉末1.0 g，固定超声功率800 W，选取乙醇浓度、提取时间、提取温度、超声时间4 个因素，改变其中1 项因素，其他因素不变进行单因素实验。各单因素变量分别是乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）、提取时间（40、60、80、100、120 min）、提取温度（40、50、60、70、80 ℃）和超声时间（10、15、20、25、30 min），提取次数均为3次。

1.3.3.2 响应面优化

在单因素实验结果的基础上，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取温度（C）和超声时间（D）为考察因素，以总皂苷提取得率为指标，采用响应面法，用Design Expert 8.0软件进行实验数据分析，进而优化穿山龙总皂苷的提取工艺。

1.3.4 穿山龙总皂苷的纯化

根据上述实验所筛选出的最优条件进行提取，将提取到的总皂苷采用正丁醇萃取，正丁醇层减压过滤浓缩得浸膏，利用非极性的AB-8 大孔吸附树脂作为吸附介质进行纯化，总皂苷用水溶解后，上样，依次用水、70%乙醇洗脱大孔吸附树脂，收集70%乙醇洗脱液，浓缩，冷冻干燥［14］。

1.3.5 体外抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除实验

参考文献［15］中的方法，测定样品清除DPPH 自由基的能力。首先制备DPPH 溶液，将24 mg 的DPPH溶解在100 mL 的甲醇中。将纯化前后的总皂苷分别用甲醇配制成浓度为1、2、3、4、5 mg/mL 的待测液。分别取3 mL 上述各浓度的总皂苷溶液置于不同试管中，再向每只试管中加入0.1 mol/L 的DPPH 溶液3 mL，充分混合后，放置25 min。以无水乙醇作对照，在波长为515 nm 的条件下测得吸光度A测定；以无水乙醇替代3 mL 总皂苷溶液，测量后得吸光度A空白；于试管中充分混合相同体积不同浓度的上述总皂苷溶液与无水乙醇，搁置30 min，以VC 溶液为阳性对照，测得吸光度A对照，计算DPPH清除率。

1.3.5.2 ABTS自由基清除实验

参考文献［16］中的方法，用ABTS 评价总皂苷纯化前后的抗氧化能力。该检测方法是基于抗氧化剂清除ABTS 自由基阳离子的能力，导致溶液在405 nm 处的吸光度降低。将7 mmol/L ABTS 自由基溶液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，将混合液在室温下于黑暗中放置12 h，得到含有ABTS自由基阳离子的深色溶液。将得到的ABTS工作液用水稀释至在405 nm 波长下测得吸光度为0.7 的浓度。将纯化前后的总皂苷配制成浓度为1、2、3、4、5 mg/mL的待测液。取0.1 mL样品溶液与1.9 mL ABTS 工作液混合，常温避光放置6 min，在波长405 nm 处测定吸光度A测定；用甲醇为空白，测定吸光度A空白；于试管中充分混合相同体积不同浓度的上述总皂苷溶液与无水乙醇，用双光束分光光度计测定溶液的吸光度，测定时间为6 min。以VC 溶液为阳性对照，测得吸光度A对照，计算ABTS清除率。

2 实验结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对穿山龙总皂苷得率的影响

在提取时间60 min、超声时间15 min、提取温度60 ℃条件下，分别考察乙醇浓度为20%、40%、60%、80%、100%时对总皂苷含量的影响，结果如图1A所示。在乙醇浓度为80%时，总皂苷的含量达到最大，因此选择60%、80%、100%浓度的乙醇作为响应面设计的3个水平。

2.1.2 提取时间对穿山龙总皂苷得率的影响

在乙醇浓度80%、超声时间15 min、提取温度60 ℃条件下，分别考察提取时间为40、60、80、100、120 min时对总皂苷含量的影响，结果如图1B所示。在提取时间为100 min 时，总皂苷的含量达到最大，因此选择80、100、120 min的提取时间作为响应面设计的3个水平。

2.1.3 提取温度对穿山龙总皂苷得率的影响

在乙醇浓度80%、超声时间15 min、提取时间100 min 条件下，分别考察提取温度为40、50、60、70、80 ℃时对总皂苷含量的影响，结果如图1C所示。在提取温度为70 ℃时，总皂苷的含量达到最大，因此选择60、70、80 ℃的提取温度作为响应面设计的3个水平。

2.1.4 超声时间对穿山龙总皂苷得率的影响

在乙醇浓度80%、提取时间100 min、提取温度70 ℃条件下，分别考察超声时间为10、15、20、25、30 min时对总皂苷含量的影响，结果如图1D所示。在超声时间为25 min时，总皂苷含量达到最大，因此选择20、25、30 min的超声时间作为响应面设计的3个水平。

2.2 响应面优化穿山龙总皂苷的提取工艺

根据单因素实验结果，采用Design Expert 8.0 软件进行实验设计，得出在上述4 个条件下所提取的总皂苷得率，通过软件分析得出最优提取工艺条件。见表1、表2。

表1 响应面分析因素与水平表

表2 响应面设计方案及结果

用实验得到的以薯蓣皂苷标示的总皂苷含量值计算二阶多项式的系数、回归系数和P值，以总皂苷的含量为响应值（Y），得到总皂苷含量对各影响因素的二次多项式回归模型。

Y=16.22+0.63×A+0.42×B+0.13×C+0.65×D+0.28×AB-0.23×AC-0.042×AD+0.072×BC-0.22×BD+0.15×CD-3.63×A2-1.45×B2-0.88×C2-1.48×D2

通过方差分析表可以看出，模型组差异有统计学意义（P＜0.000 1），失拟项差异无统计学意义（P=0.132 4 ＞0.05），说明回归方程的可靠性及显著性较好。拟合模型R2=0.937 8，预测模型R2Adj=0.875 7，变异系数CV=5.37%，说明实验中所得的结果与响应面软件预测值较为接近，实验所得结果误差较小，由此可知该方法拟合度良好，表明用可以该方法来对总皂苷的得率结果进行预测和分析，同时也说明了该实验的稳定性较好，见表3。两两因素交互作用见图2。可见，各因素对穿山龙总皂苷得率的影响为超声时间（D）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（B）＞提取温度（C）。

表3 回归方程的方差分析

利用Design-Expert 8.0 软件求出回归模型的最大值，即超声波辅助提取穿山龙总皂苷的最优条件为：乙醇浓度80%、提取时间80 min、提取温度80 ℃、超声时间25 min，在此提取条件下，穿山龙总皂苷的含量为16.24%，RSD值为2.92%。见表4。

表4 最佳提取工艺的验证实验

2.3 穿山龙总皂苷的纯化

将根据上述最优条件提取到的总皂苷进行正丁醇萃取，正丁醇层减压过滤浓缩得浸膏，利用非极性的AB-8 大孔吸附树脂作为吸附介质进行纯化，总皂苷用水溶解后，上样，依次用水、70%乙醇洗脱大孔吸附树脂，收集70%乙醇洗脱液，浓缩，冷冻干燥。测定纯化后总皂苷的含量，重复测量3 次，纯化后的总皂苷平均含量为50.49%，RSD值2.42%。

2.4 体外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH 自由基清除能力

在相同浓度下，VC 的DPPH 自由基清除能力远大于纯化和未纯化的总皂苷，纯化的总皂苷大于未纯化的总皂苷。未纯化的总皂苷、纯化后的总皂苷IC50值分别为4.9、3.8 mg/mL。见图3A。

2.4.2 ABTS自由基清除能力

在相同浓度下，VC 的ABTS 自由基清除能力远大于纯化和未纯化的总皂苷，纯化的总皂苷大于未纯化的总皂苷。未纯化的总皂苷、纯化后的总皂苷IC50值分别为2.8、2.2 mg/mL。见图3B。

3 讨论

随着对穿山龙研究的深入，穿山龙总皂苷的最佳提取方法及其众多的药理作用受到越来越多的关注［17-19］。本研究中，利用响应面法优化提取条件，以获得最大的总皂苷提取率，研究结果表明乙醇浓度、提取温度、超声时间和提取时间对穿山龙总皂苷的提取率有较大的影响。

乙醇浓度对总皂苷的提取率影响最大，当乙醇浓度从20%增加到80%时，总皂苷的得率逐步上升，当乙醇浓度为80%时，得率达到最高值，根据相似相溶理论，当溶剂与溶质的极性相似时，皂苷更容易从细胞中溶解［20］。提取时间对总皂苷得率也有影响，提取时间在20～100 min 时，总皂苷的得率呈上升趋势，提取速度变缓，当提取时间增加到100 min 时，总皂苷的得率变化不明显，可能原因是随着提取时间的增加，穿山龙中更多的蛋白质和多糖溶解在溶剂中，阻碍了皂苷的溶解［21］，因此，为了提高提取效率和节约能源，选择提取时间为100 min。在研究提取温度对总皂苷得率的影响时发现，随着温度上升，总皂苷得率增加，可能原因是高温使皂苷分子运动加快，有利于穿山龙总皂苷的溶出［22］，高温还可以使皂苷在溶剂中的溶解度增加［23］，导致得率增加，除此之外，还可能是由于超声时已经破裂的细胞组织在回流提取中通过热量从基质中释放皂苷［24］，当温度增加到70 ℃时，总皂苷的得率略有下降，可能是因为温度升高，导致某些有效成分的分解或促进了皂苷氧化等副反应，使总皂苷得率下降。超声时间也会影响总皂苷的得率，由于超声通过乙醇溶剂的振幅较大，产率也会增加，可能是因为超声时间越长，穿山龙粉末的分子间振动就越剧烈，另一方面是由于超声波刺激了植物细胞壁的破裂，并通过微射流和声流促进冲洗细胞内容物［25］，因此提取率升高，故结合工艺的成本，选择最佳的超声时间为25 min，随着超声时间的增加，得率下降，可能原因是超声增加空化过程中溶剂中的气泡数，从而降低超声能量传递到介质中的效率［26］，降低了总皂苷得率。

最新研究发现，有多种中药植物中含有抗氧化能力很强的化学物质，可以作为合成抗氧化剂的替代品［27］。国外研究报道，各种药用植物，同种植物的不同部分都有一定的抗氧化性，其中皂苷、黄酮、多糖、酚类化合物都有一定的抗氧化性［28］。在本次抗氧化作用实验研究中，总皂苷纯化前后都可以使自由基脱色，采用DPPH、ABTS清除试剂测定其抗氧化性，穿山龙总皂苷纯化后的抗氧化性大于未纯化的抗氧化性，然而二者的差别不大，说明总皂苷在进行纯化时，弃掉了一部分酚类或者其他的化合物，导致这种现象的发生。

4 结论

本文以穿山龙总皂苷为研究对象，采用单因素与响应面相结合的方式对超声波辅助提取穿山龙总皂苷的工艺进行了优化，结果表明，响应面分析的二次模型拟合程度较高，影响总皂苷得率的因素主次顺序是超声时间（D）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（B）＞提取温度（C）；提取的最佳工艺为：乙醇浓度80%、提取时间80 min、提取温度80 ℃、超声时间25 min，在此条件下，总皂苷的含量为16.24%，实验数据稳定。总皂苷经过AB-8 大孔吸附树脂进行纯化，纯化后的总皂苷含量为50.49%。

本研究分别采用DPPH、ABTS 自由基清除两种体外抗氧化实验对总皂苷纯化前后的抗氧化活性进行评价。实验结果表明，穿山龙总皂苷纯化前后对DPPH和ABTS 自由基都有一定的清除能力，但清除能力都较VC 弱；总皂苷纯化后比未纯化的总皂苷体外抗氧化能力增强；其抗氧化活性随质量浓度的增大呈上升趋势，穿山龙总皂苷具有抑制自由基生成的作用。