基于“骨肉不相亲”理论探讨绝经后骨质疏松症的代谢组学研究

孙娜，刘瑶，徐琬梨✉，刘国岩

（1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014；2.山东省中医院，山东 济南 250014）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种与女性生理周期相关的由雌激素戒断引起的系统性骨骼疾病［1-2］，主要特征为骨量减少及骨的力学结构改变，后期易致畸、致残，严重影响患病人群的生活质量，已成为全球性公共卫生问题之一。因此，探明PMOP的分子机制成为亟待解决的问题。近年来，越来越多的研究表明，PMOP的发生与相关基因、蛋白质等生物大分子的表达水平异常密切相关［3-8］。中医学中虽无骨质疏松症之名，但类似症状古籍多有记载，该病属“骨痿”范畴，其中“骨肉不相亲则肉软却……发无泽者骨先死”及“骨枯而髓减，发为骨痿”等表明骨痿病机与“骨肉不相亲”密切相关。现代医家在此基础上结合“肾主骨”“脾主肉”理论对PMOP进行临床研究，治疗方向由肾论治转向脾肾论治，治疗效果较为显著［9］，但“骨肉不相亲”致PMOP的系统病理机制尚不明确。为了探明该病理机制，本研究拟通过检测PMOP脾肾亏虚证患者、PMOP肾虚证患者及正常对照人群的血清差异代谢物，寻找PMOP脾肾亏虚证患者体内发生独特改变的代谢通路及网络，以期从代谢组学角度揭示该病病理机制的同时，为该病靶向治疗提供数据支持［10-11］。

1 材料与方法

1.1 研究对象

结合证候辨证素量表，选取山东省中医院骨科收治住院且经测定骨密度后确诊的30例PMOP脾肾亏虚证患者（脾肾亏虚组）和30例PMOP肾虚证患者（肾虚组），以及18例健康人（正常组）作为研究对象。本研究共收集78例受试者的血清资料，参与本研究的人群均被明确告知血液用途。年龄、绝经年龄、身高、体质量、BMI方面的基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组基线资料比较（±s）

表1 各组基线资料比较（±s）

组别脾肾亏虚组肾虚组正常组例数30 30 18年龄（岁）55.22±3.56 54.83±2.98 53.65±3.87绝经年龄（岁）51.20±1.66 50.73±1.32 50.87±2.01身高（cm）154.56±4.26 153.36±3.68 154.97±3.94体质量（kg）47.45±2.30 45.79±1.96 45.92±2.60 BMI（kg/m2）19.45±2.63 20.31±3.12 19.93±3.01

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

参照《原发性骨质疏松症诊疗指南》［12］，以脆性骨折程度或DXA 骨骼密度测量结果为准，若该值≤-2.5则可确诊。

1.2.2 中医诊断标准

参照2011 版《中医诊断学》［13］、2013 版《绝经后骨质疏松症》［14］及《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识（2020）》［15］，共同制定本研究的中医证型诊断标准。肾虚证：主症为腰膝酸软，失眠健忘；次症为头晕耳鸣，耳聋，发脱齿摇，性欲减退，尿有余沥，尿失禁，尺脉沉迟，舌淡苔白，面色晦暗等。脾肾亏虚证：主症为腰膝酸软，倦怠乏力；次症为四肢怠惰，大便溏薄，纳呆食少，脘腹胀满，面色㿠白，懈惰嗜睡，注意力不集中，苔白，脉沉细等。主症满足1～2 项，次症满足2～3 项即可确诊。

1.3 纳入标准

①符合上述诊断标准；②均绝经1年以上；③临床资料相对完整；④自愿参与本研究；⑤中医证型确诊无疑义。

1.4 排除标准

①有各种影响骨代谢疾病的病史；②有血液系统疾病；③有慢性肾功能不全、恶性肿瘤病史；④有长期糖皮质激素使用史及免疫抑制剂治疗史。

1.5 血清采样方法

采集样本前3 d，嘱患者停药以免药物对本研究结果造成干扰。晨起对患者进行空腹静脉取血，并于室温下离心5 min，取上层血清，将其置于-80 ℃的冰箱中，等待检测。

1.6 样本预处理

室温条件下解冻各组血清，取样本200 µL 和400 µL 缓冲液（45 mmol/L NaH2PO4/K2HPO4；0.9%NaCl；pH 值7.4；50%D2O）置于1.5 mL 的离心管中，进行充分的混匀斡旋、震荡。置于4 ℃环境下离心10 min，分出上层清液550µL，并置于5 mm 核磁管（Wilmad-LabGlass）中等待下一步实验。

1.7 H-NMR数据的采集及处理

核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）实验中所用的仪器是Varian 600 MHz谱仪，1H共振频率是599.93 MHz。将核磁共振管放入并进行匀场锁场（锁场信号为重水信号），利用自波回旋法，横向弛豫加权实验中，选用水峰抑制Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，并设置25 ℃下弛豫延迟时间为2.0 s，采集时间是1.5 s，谱宽为12 000.0 Hz，总回波时长设置100 ms，累加64次。

1.8 统计学方法

采用MestReNova（V9.0.1）对H-NMR采集处理后的原始数据进行傅里叶变换、基线校正及定标处理后，对其进行多元变量模式识别分析，主要包含主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。对比OPLS-DA各模型中代谢物的相关系数，将每一个变量的Loading值与其标准偏差相乘后进行数据的回溯转换，统计总结出具有统计学意义（P＜0.05）的血清差异代谢物。

2 代谢组学结果

2.1 代谢谱分析

使用SIMCA 软件［16］（V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden）将正交变换转换为线性不相关变量，自动建模分析后发现脾肾亏虚组、肾虚组与正常组间的代谢谱有明显分离，解释数据变量具备进一步研究的意义。见图1。

2.2 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

采用OPLS-DA 的方法对数据进行进一步处理［17］。见图2。其中脾肾亏虚组、肾虚组样本与正常组相比数据分离较为明显，表明有进一步研究价值。为了进一步验证各两组模型是否具备可靠性和较高的预测率，对数据进行置换检验，得出结果R2Y、Q2值接近1。见图3。各组间数据的OPLS-DA 载荷图见图4，图中横坐标意为化学位移，纵坐标表明载荷值。红色为正相关，且颜色的深浅程度与相关系数成正比；蓝色为负相关，颜色的深浅程度随相关系数的增长而变浅。图4中各标记物质在相关系数方面已通过临界值检验。

2.3 差异代谢物筛选

研究OPLS-DA模型时，各个组间排列检验所示结果对应不同系数，分析整理得出具备统计学意义的所有组间血清差异代谢物明细。将相关系数图中的所有变量Loading 值与其标准偏差相乘，对数据进行回溯转换，将绝对值与0.361 比较，得组间存在的差异代谢产物。见表2。

2.4 KEGG通路分析

通过在线网站Metascape（https：//metascape.org）对表1中的差异代谢物进行KEGG 通路分析，得出相关通路及通路中包含化合物［18］。见表3。

表3 富集通路注释信息表

2.5 差异代谢物的代谢通路分析

将表2中的差异代谢物导入在线代谢网站MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca）进行测算，得出代谢物相关通路，将其中影响因子＞0.05的重要通路纳入分析。结果：Valine，leucine and isoleucine biosynthesis为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成代谢；Valine，leucine andisoleucine degradation 为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解代谢；Aminoacyl-tRNA biosynthesis为氨基酞-tRNA合成代谢；Glycolysis or Gluconeogenesis为糖酵解/糖异生；Glycerophospholipidmetabolism 为甘油磷酸代谢；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 为乙醛和二梭酸代谢；Methane metabolism 为甲烷代谢；Pyruvate metabolism 为丙酮酸代谢；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 为乙醛和二羧酸代谢；Glycerophospholipid metabolism为甘油磷酸代谢；Glycolysis or Gluconeogenesis为糖酵解/糖异生；Pentose phosphate pathway为戊糖磷酸途径；Galactose metabolism 为半乳糖代谢；Starch and sucrose metabolism 为淀粉和蔗糖代谢；Citrate cycle（TCA cycle）为柠檬酸循环（TCA循环）。见图5。

表2 脾肾亏虚组、肾虚组与正常组间的差异代谢物

3 讨论

“骨肉不相亲”理论相关记载最早见于《灵枢·经脉》，如“骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却”，《灵枢·癫狂》及《素问·生气通天论》中亦有相关表述，如“骨正筋柔，气血以流，腠理以密，如是则骨气以精”，高度概括了骨与肉之间的内在平衡关系，是中医学对肌骨协同病变病理机制的系统性总结。现代医学证明骨与肌肉共同起源于轴旁中胚层，在解剖位置中相互依存，且各自作为内分泌器官，通过分泌激动因子、骨因子及代谢产物等共同参与包括PMOP 在内的增龄性肌骨疾病病理过程［19-21］，这与中医学骨肉关系及骨肉协同致病理论具有一致性。除此之外，通过骨应力生物力学机制探查骨、肌肉与PMOP 之间的联系也取得了一定成果，如骨细胞感受应力刺激信号后可产生骨钙素等因子调控骨稳态平衡及骨骼肌强度［22］，据此认为适宜强度的应力刺激有利于改善PMOP 等增龄性肌骨疾病的症状。相关研究表明，骨功能下降时，肌肉的力量及功能亦得不到很好的发挥，影响机体的平衡能力及稳定性，进一步证明骨、肌肉功能异常可以导致PMOP的发生［23］。

《类经》中“脾主肌肉故脾绝则肉先死，肾主骨故肾绝则骨先死”及“治痿独取阳明”将“骨肉不相亲”理论从肌骨关系深化到脾肾生克制化。肾为先天之本，主骨生髓，女子绝经后天癸消失，肾精亏损严重，“尺濡则骨肉不相亲”表明肾精亏虚易发为骨痿。此时，先天之精不能对后天之精产生足够的滋养作用，后天之精的化生之源脾胃发生亏虚，后天之精充养先天之精的功能不足以发挥，久之脾肾皆虚，促进“骨痿”的产生。现代医学研究中，运用补肾健脾法治疗骨质疏松症取得了一定进展，如用补中益气丸联合补中益气汤可以提高绝经后骨质疏松症患者的雌激素水平及调节免疫炎症反应等，与中医脾肾皆虚致骨痿理论有一致性［24-26］，但脾肾亏虚致骨痿的系统病理机制目前仍不明确，需进一步研究探索。

现代研究中，通过代谢组学方法探讨脾肾亏虚型PMOP的有效治疗方式取得了一定进展［27］，本研究在此基础上，拟通过探查脾肾亏虚型PMOP患者血清中的特异代谢产物及其影响的代谢通路，为阐明脾肾亏虚致PMOP 的系统病理机制提供数据支持。本研究采取代谢组学方法，发现PMOP肾虚组患者血清中差异代谢物包括乙醇胺、甲酸、异丁酸、异亮氨酸、丙二酸盐、亮氨酸、低密度脂蛋白、丙二酸盐、α-葡萄糖及β-葡萄糖；发生改变的通路主要包括蛋白质消化和吸收，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，碳代谢，氨酰tRNA 生物合成，2-氧代羰基酸代谢，ABC 转运蛋白，矿物吸收，癌症中心碳代谢以及糖酵解/糖异生。对比肾虚组数据，认为PMOP 脾肾亏虚组特有的血清差异物为甘油和丙酮酸，发生改变通路包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖磷酸途径、丙酮酸代谢及半乳糖代谢。

糖酵解第一阶段过程中，半乳糖代谢产生的D-葡萄糖在已糖激酶、葡萄糖激酶的作用下，分子结构中的碳氢键断裂释放能量，生成的磷酸果糖参与戊糖磷酸途径；第二阶段过程中D-葡萄糖在破骨细胞肌动蛋白环附近丙酮酸激酶等一系列酶的催化下最终转化为丙酮酸，经历丙酮酸代谢、辅酶A合成等调控骨降解能量途径［28］，这可能是脾肾亏虚组患者血清差异物丙酮酸影响PMOP 发生的体内途径。甘油酯代谢途径的初始化合物3-磷酸甘油酸既可以来自糖酵解过程，也可以源于甘油，而半乳糖代谢中D-半乳糖可以在α-半乳糖苷酶的催化下生成甘油。甘油参与脂质代谢并产生重要能量物质-脂肪酸、甘氨酸和胆固醇，血液中游离脂肪酸含量增加时可以影响过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferation activates the receptor，PPAR）的表达［29］。该受体中的PPARα和PPARδ对破骨细胞的生成和骨吸收具有抑制作用，而PPARγ 有利于加速破骨细胞的生成进程，PPARα、PPARδ和PPARγ共同参与三羧酸循环促进破骨细胞的分化，加速骨质流失，发为PMOP［30-35］，这可能是脾肾亏虚组患者血清差异物甘油影响PMOP 发生的体内机制。本研究中PMOP 脾肾亏虚组患者血清内的甘油含量增加，表示与甘油相关的脂质代谢发生紊乱，相关研究也支持这一结论［34］。

作为与衰老明确相关的代谢途径［36］，丙酮酸代谢中丙酮酸可以在甲酸-C-乙酰转移酶的作用下生成甲酸参与乙醛酸和二羧酸代谢途径，也可以经由丙酮酸脱氢酶、乙酰转移酶催化后生成2-氧戊二酸盐继而转化成乙酰辅酶A参与三羧酸循环。三羧酸循环途径作为体内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成的重要来源之一，对调控机体的能量代谢平衡具有重要意义，与能量代谢密切相关，由此可见PMOP脾肾亏虚组患者丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢途径改变，意味着能量代谢异常。PMOP本质为骨吸收大于骨生成，而骨吸收活性增强过程中需要消耗大量的ATP，结合研究过程中与能量代谢相关的戊糖磷酸途径产生异常，认为PMOP 脾肾亏虚组患者在破骨细胞能量代谢方面存在异常。有研究认为破骨细胞的骨吸收强烈依赖于能量消耗，亦一定程度上支持本结论［23］。

戊糖磷酸途径中，葡萄糖可在葡萄糖酸内酯酶、葡萄糖酸脱水酶的作用下转化为丙酮酸，经甘油酸酯分解后参与糖酵解过程。戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化过程中，半乳糖醛酸酯在D-半乳糖醛酸还原酶等一系列还原酶的催化作用下生成甘油，参与脂质代谢。乙醛酸和二羧酸盐代谢过程中产生的丙酮酸参与甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢途径时，产生的代谢产物羟基丙酮酸在某些条件下可以进一步生成ATP［37］及L-谷氨酰胺，其中L-谷氨酰胺消耗时可抑制破骨细胞的分化和表达［23］，进而实现对PMOP 的调控作用，一定程度上增加本研究结果的可信度。

基于以上数据，本研究认为PMOP 是一种以能量代谢、脂质代谢紊乱为特征的慢性代谢疾病，相关研究亦得出相同结论，一定程度上为本研究增加可信度［38-39］。本研究中的PMOP 脾肾亏虚组中甘油含量及相关脂质代谢途径异常表明患者出现脂代谢紊乱，结合“骨肉不相亲”理论，中医中“肉”的广义概念不局限指代肌肉，还包括脂肪，故下一步研究将增加脂肪相关的观察指标，完善“骨肉不相亲”理论下的骨肉关联内容，以期从分子生物学方面为探索PMOP 的发病机制提供方向，更好地指导临床。