响应面法优化酶菌协同制备高抗氧化活性青钱柳发酵粉工艺

张 良，刘媛洁，严美婷，张超凤

（1.江西省食品发酵研究所，江西宜春 336000；2.江西医学高等专科学校，江西上饶 334000）

青钱柳又名摇钱树，广泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地，是中国特有、国家二级保护的珍惜树种。青钱柳叶中含有黄酮、多糖、三萜、有机酸类等多种天然功能性活性物质，在降血糖、降血压、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效。基于青钱柳叶的药食兼用的价值，青钱柳叶茶已通过美国食品药品管理局的认证，青钱柳叶已列入中国新资源食品原料目录。青钱柳多糖、黄酮、三萜是青钱柳叶中主要的活性物质并具有较好的抗氧化活性。

酶菌协同发酵是指原料经酶解工艺后，再经微生物菌种发酵的过程。酶菌协同发酵工艺应用于青钱柳叶过程，能提高天然活性物质的溶出量，同时可去除青钱柳的苦涩味。杨洁芳等利用酶菌协同工艺制备的大豆肽含量与实验室制备的酶解肽相比，其DPPH 自由基清除率提高106.92%，同时解决了单一酶解时酶解产物带有苦味的问题。张倩茹等利用酶菌协同发酵玉米芯制备的木聚糖，与对照组相比木聚糖含量显著提高了257%。研究表明酶菌协同发酵效果优于菌和酶单独使用时的效果。毛传亮等研究了青钱柳叶醇提后的水提物对DPPH 自由基的清除率为91.29%，郑晓杰等发现浙江文成8 月份青钱柳的DPPH 清除能力为162.26 μmol AAE/g dm。但关于青钱柳叶酶解或发酵后的抗氧化活性的研究较少。

本研究以产自江西九江修水县的青钱柳叶为原料，应用酶菌协同发酵工艺制备高抗氧化活性的青钱柳发酵粉，解决了单一酶解时青钱柳有苦涩味问题和单一微生物发酵酶系不足等问题，对制备适口性强和高抗氧化活性成分的产品有一定的产业化意义，为青钱柳叶的精深加工和高值化利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青钱柳叶 江西九江市修水县；半纤维素酶（10 万 U/g）、纤维素酶（10 万 U/g）宁夏和氏璧生物技术有限公司；植物乳杆菌（）、酿酒酵母（）江西省食品发酵研究所菌种保藏中心提供；DPPH（纯度≥98%）Sigma 公司；MRS 培养基、PDA 培养基北京陆桥技术股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

752N 紫外可见分光光度计 上海仪电分析；HHS-6恒温水浴锅 南通三思机电有限公司；FA1204B 电子天平 上海精科天美有限公司；SH-100C 恒温摇床 英检达仪器（重庆）有限公司；KH22R 高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；LGJ-100F 冻干机 上海豫明仪器有限公司；250B 生化培养箱苏州威尔实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养 挑取4 环斜面植物乳杆菌接种到装有80 mL 的MRS 液体培养基的250 mL 三角瓶后，恒温摇床（35 ℃，140 r/min）培养24 h；挑取4 环斜面酿酒酵母接种到装有80 mL PDA 培养基的250 mL 三角瓶后，恒温摇床（30 ℃，140 r/min）培养24 h。将培养完成的植物乳杆菌和酿酒酵母菌液按照一定的质量比混合后，制备成发酵用的混合菌种。

1.2.2 青钱柳酶菌协同发酵工艺 将经干燥粉碎后过20 目筛的青钱柳叶，按照一定的料液比，将青钱柳叶细粉和蒸馏水装于250 mL 三角瓶中摇匀。按照青钱柳叶细粉质量的百分比添加复合酶（纤维素酶和半纤维素酶）于装有青钱柳细粉液的三角瓶中，在55 ℃、pH5.0 条件下，恒温水浴酶解3.0 h。按照酶解后酶解液总质量的百分比添加蔗糖，经121 ℃、0.12 MPa 高压灭菌20 min 后冷却，按照酶解液总质量的百分比接种混合菌（植物乳杆菌和酿酒酵母按一定质量比混合），置于恒温摇床内（32 ℃，140 r/min）培养36 h。在5 ℃和8000 r/min 条件下，发酵液离心15 min 后取上清液，50 ℃下旋转浓缩后，真空冷冻干燥（预冻温度为-40 ℃，预冻时间为6 h，干燥气压为50 Pa，干燥时间48 h）获得青钱柳发酵粉。

1.2.3 单因素实验 按照1.2.2 的工艺条件，固定单因素实验条件：料液比为1:8 g/mL，复合酶添加量为0.6%，复合酶（纤维素酶和半纤维素酶）质量比为1:1 g/g，酶解时间为3.0 h，蔗糖添加量为6%，混合菌添加量为4%，混合菌（植物乳杆菌和酿酒酵母）质量比为1:1 g/g，发酵时间为36 h。

分别考察料液比（1:4、1:8、1:12、1:16、1:20、1:24 g/mL）、复合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、复合酶质量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）、酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、混合菌添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、混合菌质量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）和发酵时间（20、28、36、42、50、58 h）对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响。

1.2.4 PB 试验 在1.2.3 的实验基础上，以料液比、复合酶添加量、复合酶质量比、酶解时间、蔗糖添加量、混合菌添加量、混合菌质量比、发酵时间为因素水平值，采用PB 试验来筛选青钱柳发酵粉对DPPH自由基清除率影响显著的因素。PB 试验设计见表1。

表1 PB 试验设计因素及水平表Table 1 Factors and levels of PB test design

1.2.5 响应面试验 在1.2.4 实验基础上，以具有显著性的响应因素复合酶添加量、复合酶质量比和混合菌添加量为自变量，以青钱柳发酵粉对DPPH 自由基清除率为响应值，设计响应面试验，具体设计见表2。

表2 响应面试验设计Table 2 Box-Behnken test design

1.2.6 DPPH 自由基清除率的测定 参照王珊珊等的方法进行测定。青钱柳发酵粉用85%的乙醇配制成不同浓度（5、10、20、40、80 mg/mL）的待测液。取20 mg/mL 浓度的待测液，按照A、A和A的实验方法，溶液混匀避光静置30 min 后测吸光度（517 nm）。

式中，A为2 mL 的待测液与等体积DPPH乙醇溶液混合反应后的吸光值；A为2 mL 待测液与等体积乙醇（85%）溶液混合后的吸光值；A为2 mL 乙醇（85%）溶液与等体积DPPH 乙醇溶液混合后的吸光值。

1.2.7 青钱柳发酵粉中主要成分的测定

1.2.7.1 青钱柳多糖含量的测定 苯酚-硫酸法，参照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》。

1.2.7.2 青钱柳总黄酮含量的测定 分光光度计法，参照SN/T 4592-2016《出口食品中总黄酮的测定》。

1.2.7.3 青钱柳总三萜含量的测定 分光光度计法，参照NY/T 3676-2020《灵芝中总三萜含量的测定 分光光度法》。

1.3 数据处理

所有实验均重复三次，数据以平均值±标准差（SD）表示，单因素实验数据用Excel 2019 整理并作图。采用Design-Expert 8.0.6 统计软件进行PB 和响应面试验设计、数据处理及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图1 可知，随着料液比的逐渐增加，青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率呈先增大后略减小的趋势。当料液比为1:12 g/mL 时，青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率最大。分析原因可能是随着料液比的增加，利于青钱柳抗氧化活性物质从组织细胞内溶出到周围溶液中，但过大的料液比也会造成有效成分的损失，从而导致青钱柳发酵粉的DPPH自由基清除率降低。同时，料液比太小则不利于青钱柳的充分发酵，料液比太大会导致发酵液中青钱柳抗氧化活性物质含量的相对减少。选择料液比为1:8～1:16 g/mL 进行PB 试验。

图1 料液比对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.2 复合酶添加量对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图2 可知，随着复合酶添加量的增加，青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率呈现先增加后逐渐减少的趋势。当复合酶添加量为0.8%时，青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率达到最大值。分析原因可能是复合酶添加量低时，青钱柳抗氧化活性物质等溶出较少，发酵液中营养元素也不是发酵菌的最佳生长条件。随着复合酶添加量的增加，底物和酶的酶解效果较好，青钱柳抗氧化活性物质等溶出较多，但发酵菌生长较快，一些活性物质等营养成分消耗也较快，导致青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率略微下降。选择复合酶添加量为0.6%～1.0%进行PB 试验。

图2 复合酶添加量对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of compound enzyme added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.3 复合酶质量比对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图3 可知，青钱柳发酵粉的DPPH自由基清除率随着复合酶（纤维素酶与半纤维素酶）中纤维素酶的质量比的增大而增加，即当复合酶质量比为2:1 时，DPPH 自由基清除率达最大值。继续增加纤维素酶的质量占比，DPPH 自由基清除率略有下降。分析原因可能是，随着纤维素酶质量比的增加，酶解出的青钱柳多糖、黄酮等抗氧化活性物质逐渐增加。发酵菌在较低的纤维素酶质量比时，生长较慢，水解出的青钱柳活性成分较少；发酵菌在较高的纤维素酶质量比时，生长较快，消耗青钱柳多糖、黄酮等营养活性物质较快，DPPH 自由基清除率略有降低。选择复合酶质量比为1:1～3:1 g/g 进行PB 试验。

图3 复合酶质量比对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of compound enzyme mass ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.4 酶解时间对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图4 可知，随着酶解时间的增加，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率呈现先增加后缓慢减少的趋势。当酶解时间达2.5 h 后，继续增加酶解时间，青钱柳发酵液中抗氧化活性物质会受酶解作用的影响发生部分水解，导致青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率降低。选择酶解时间为2.0～3.0 h 进行PB 试验。

图4 酶解时间对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.5 蔗糖添加量对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图5 可知，随着蔗糖添加量的增加，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率呈先递增后略降低的趋势。当蔗糖添加量为8%时，DPPH 自由基清除率达最大值。分析原因可能是作为培养基的蔗糖浓度过高，发酵菌种的细胞的渗透压过大，菌体生长缓慢，青钱柳发酵液中抗氧化活性成分含量减少，导致DPPH 自由基清除率降低。选择蔗糖添加量为6%～10%进行PB 试验。

图5 蔗糖添加量对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of sucrose addition on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.6 混合菌添加量对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图6 可知，青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率随着混合菌添加量的增加呈先增加后略降低的趋势。当混合菌添加量为5%时，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率达最大值。继续增加混合菌添加量，DPPH 自由基清除率略下降。分析原因可能是混合菌添加量达到一定量后继续增加，会使培养基中营养物质不能满足发酵菌种的生长，同时消耗培养基中的多糖、黄酮等活性物质作为营养来满足菌种的生长，导致青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率降低。选择混合菌添加量为4%～6%进行PB 试验。

图6 混合菌添加量对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of mixed bacteria added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.7 混合菌质量比对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图7 可知，DPPH 自由基清除率随混合菌（植物乳杆菌和酿酒酵母）中植物乳杆菌的增加，呈现先升高后降低的趋势。混合菌在生长过程中，会分泌不同的水解酶，有利于细胞组织结构中抗氧化活性物质释放到发酵液中。混合菌质量比的不同，菌种自身生长和代谢所需要的营养物质不一样，菌种间相互生长和代谢的制约程度不一样，由图7 可以看出，当混合菌质量比为2:1 时，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率达最大值。选择混合菌质量比为1:1～3:1 g/g 进行PB 试验。

图7 混合菌质量比对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响Fig.7 Effect of mass ratio of mixed bacteria on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.8 发酵时间对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响 由图8 可知，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率随着发酵时间的延长，呈现先增加后减少的趋势。当发酵时间为42 h 时，DPPH 自由基清除率达最大值，为69.2%。发酵时间超过42 h 后，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率有所下降，分析原因可能是发酵菌种进入生长的衰老期，分泌的酶量不再增加，同时发酵菌产生了能降解青钱柳抗氧化活性物质的酶，使DPPH 自由基清除率有所降低。选择发酵时间为36～50 h 进行PB 试验。

图8 发酵时间对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响Fig.8 Effect of fermentation time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.2 PB 试验结果

表3 与表4 分别为PB 试验设计及结果和方差分析。

表3 PB 设计的各因素水平及响应值Table 3 Experimental design and response results of PB design

表4 PB 设计方差分析Table 4 Analysis of variance of PB design

对表3 中的实验数据进行分析，结果见表4。模型的值为0.0178，表示该模型（＜0.05）显著；从各因素的值可以看出B（复合酶添加量）、C（复合酶质量比）和F（混合菌添加量）对青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率的影响显著（＜0.05）。因此选择复合酶添加量、复合酶质量比和混合菌添加量共3 个因素进行响应面试验。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果分析 在2.1 和2.2的实验结果的基础上，固定不显著影响因素料液比1:12 g/mL、酶解时间2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌质量比2:1 g/g、发酵时间42 h。以复合酶添加量（X）、复合酶质量比（X）和混合菌添加量（X）3 个因素进行响应面试验。响应面试验设计及结果见表5。

对表5 进行统计分析，进而获得实验数据的方差分析（见表6）。经多元回归拟合，模型的二次多项式方程为：

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

表6 响应面试验方差分析Table 6 Analysis of variance in Box-Behnken experiment

由表6 可知，该模型＜0.0001，表明建立的模型极显著（＜0.01）；失拟项值不显著，表明建立的模型拟合度较好；方程的校正决定系数和决定系数分别为0.9764 和0.9897，表明约有97.64%的响应值变化能由该模型进行解释，实际实验与模型建立的方程拟合度较好，能用于分析和预测青钱柳酶菌协同发酵的工艺优化。对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响极显著（＜0.01）的因素为X、X、XX、X、X、X，对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率影响显著的因素为XX（＜0.05），其他因素均不显著（＞0.05）。模型的值越大对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响越大。可见，各因素对酶菌协同发酵青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率的影响程度为：X（混合菌添加量）＞X（复合酶添加量）＞X（复合酶质量比）。

对回归方程进行响应面分析，自变量因素相互间交互作用的响应曲面图见图9。自变量因素对响应值的影响与响应面坡度陡峭程度呈正相关；等高线呈椭圆形的程度与两个自变量交互作用的程度呈正相关。由图9 可知，对响应值的影响较大的交互作用为XX和XX。随着各因素数值的增大，青钱柳发酵粉对DPPH 自由基清除率呈现先增大后减少的趋势，响应面呈凸型陡峭曲面，对应的等高线呈椭圆形，表明XX和XX的交互作用显著，DPPH自由基清除率存在极大值。

图9 交互项对青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率影响的响应面Fig.9 Response surface analysis of the effects of interaction terms on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.3.2 最优工艺条件及验证试验 根据模型的回归方程分析获得最佳的青钱柳酶菌协同发酵工艺条件为：料液比1:12 g/mL、复合酶添加量0.76%、复合酶质量比2.17:1 g/g、酶解时间2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.83%、混合菌质量比2:1 g/g、发酵时间42 h。在此最佳条件下，青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率理论上可达82.84%。考虑具体实验的可操作性，修正最佳条件为：料液比1:12 g/mL、复合酶添加量0.80%、复合酶质量比2.20:1 g/g、酶解时间2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.80%、混合菌质量比2:1 g/g、发酵时间42 h，在此条件下，得出实际的DPPH 自由基清除率为82.17%（RSD=1.19%），与预测值的相对误差为0.81%，说明该模型准确度良好。

2.4 青钱柳发酵粉主要成分分析

按照1.2.2 工艺条件，对青钱柳叶细粉未进行酶解和发酵工艺，制备成青钱柳粉对比样品，再与青钱柳发酵粉进行主要活性成分比对，见表7。

表7 青钱柳发酵粉的主要活性成分分析Table 7 Analysis of main active components of Cyclocarya paliurus fermented powder

由表7 可知，青钱柳叶细粉经酶菌协同发酵后，与未经处理的青钱柳粉相比，青钱柳发酵粉中的多糖、总黄酮和总三萜等抗氧化活性物质成分含量显著增加（＜0.05）。在酶解过程中，青钱柳叶细粉经纤维素酶和半纤维素酶的作用后释放出多糖等活性物质和营养成分，再经植物乳杆菌和酵母菌的发酵后，进一步促进了功能性活性成分的溶出，同时一些抗氧化活性物质由结合态转化为游离态，抗氧化活性成分含量增加的同时，DPPH 自由基清除率也显著增加（＜0.05）。

3 结论

以青钱柳发酵粉DPPH 自由基清除率为响应值，在单因素实验后通过PB 和响应面试验优化了青钱柳酶菌协同发酵工艺，最终获得最佳的工艺条件为：料液比1:12 g/mL、复合酶添加量0.80%、复合酶质量比2.20:1 g/g、酶解时间2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.80%、混合菌质量比2:1 g/g、发酵时间42 h。在此条件下，青钱柳发酵粉DPPH自由基清除率为82.17%。

青钱柳叶细粉经酶菌协同发酵后，与未处理的青钱柳粉对比，青钱柳发酵粉的DPPH 自由基清除率增加了159.9%；青钱柳多糖含量为8.26 g/100 g，增加了194.0%；青钱柳总黄酮含量为9.15%，增加了72.0%；青钱柳总三萜含量为9.28%，增加了52.6%。可见，经酶菌协同发酵制备的青钱柳发酵粉中多糖、总黄酮、总三萜等抗氧化物质显著增加，为青钱柳的精深加工和高效利用提供新的开发思路和途径。