LncRNA MAGI2-AS3导致鼻咽癌细胞放疗抵抗的作用机制研究*

戴润芝，徐 莲，彭先兵

湖北省十堰市人民医院/湖北医药学院附属人民医院耳鼻咽喉科,湖北十堰 442000

鼻咽癌占所有头颈部恶性肿瘤的50%，全世界每年报告的鼻咽癌新病例约为8万例。同时，鼻咽癌是一种具有独特地理分布特征的恶性肿瘤，主要分布在中国南方、东南亚和北非[1]。一部分鼻咽癌患者在诊断时就有颈部和(或)远处器官的转移，再加上鼻咽局部解剖的局限性、肿瘤侵袭性生长特性，使得放射治疗(放疗)成为鼻咽癌治疗的首选方式。鼻咽癌细胞对放疗相对敏感，大部分鼻咽癌患者可以通过放疗实现临床治愈，然而仍有部分患者在放疗过程中会发生放疗抵抗。放疗抵抗是鼻咽癌患者复发的主要原因，复发患者的5年生存率仅为25%～35%，预后极差[2]。然而，人们对放疗抵抗的机制尚未完全了解。长链非编码RNA含有WW和PDZ结构域2的膜相关鸟苷酸激酶反义RNA3(LncRNA MAGI2-AS3)是近年来新发现的长链非编码RNA之一，与肿瘤的发生、发展密切相关，调控肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移和耐药等恶性生物学行为[3-5]。研究显示，LncRNA MAGI2-AS3在胃癌和结直肠癌等恶性肿瘤中发挥促癌作用[6-7]，在非小细胞肺癌和乳腺癌中发挥抑癌作用[8-9]，表明LncRNA MAGI2-AS3在不同肿瘤中发挥不同的作用。CAO等[5]报道发现，LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌中促进顺铂耐药性。但LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌放疗抵抗中的作用未知，因此本文对此进行了研究，为逆转鼻咽癌放疗抵抗提供新的方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 从本院获得70例鼻咽癌组织和与其配对的癌旁组织，其中放疗敏感鼻咽癌组织及癌旁组织各32例，放疗抵抗鼻咽癌组织及癌旁组织各38例。所有鼻咽癌组织均经两位及以上的病理学专家确诊。放疗敏感及抵抗的评价根据国际标准进行[10]，所有患者在放疗结束后3个月进行鼻内窥镜和鼻咽CT检查：肿瘤消失，鼻咽软组织恢复为完全缓解(CR)；肿瘤消失50%以上，鼻咽结构大部分恢复正常为部分缓解(PR)；肿瘤体积缩小<50%，大部分鼻咽结构未恢复正常为病情稳定(SD)；肿瘤体积增大为疾病进展(PD)。CR和PR患者被认为是临床放疗敏感患者，SD和PD患者被认为是临床放疗抵抗患者。本研究获得医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.2主要试剂与材料 Trizol试剂和二奎啉甲酸法(BCA)蛋白质检测试剂盒购自美国Thermo试剂公司；反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购自美国Grand Island生物技术公司；鼻咽癌细胞CNE2购自美国ATCC细胞库；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素溶液和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司；LncRNA MAGI2-AS3小干扰RNA(siRNA)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen试剂公司；CCK8试剂购自美国Sigma试剂公司；细胞周期检测试剂盒购自中国上海碧云天生物试剂有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自中国南京凯基生物试剂有限公司；甲醇溶液、结晶紫染色液购自北京索莱宝试剂公司；放射免疫沉淀(RIPA)裂解液购自上海申能博采生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Promega公司；细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、凋亡蛋白活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase9、GAPDH一抗、辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔、羊抗鼠二抗购自英国Abcam公司。BALB/c-nu雄性裸鼠(鼠龄：3～5周；体质量：20～28 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR Trizol用于从鼻咽癌组织及癌旁组织和细胞中提取总RNA。检测RNA样品的纯度与水平，A260/A280为1.8～2.0时表明样品合格。按照RT-qPCR试剂盒说明书，将5 μg总RNA反转录为cDNA，并以cDNA作为模板进行扩增反应。反应体系为300 ng cDNA 2.0 μL，1×PCR缓冲液 5.0 μL，200 μmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)4.0 μL，80 pmol/L PCR正向引物0.4 μL，80 pmol/L PCR反向引物0.4 μL，Taq酶1.0 μL，用DEPC水补足体积至25.0 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸，共30个循环。然后在 2 ℃最终延伸10 min。每个样品包括3个重复孔。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt公式计算LncRNA MAGI2-AS3的相对表达水平。Ct指实时荧光强度达到设定阈值且扩增呈对数增长时的扩增循环数。所用引物序列：LncRNA MAGI2-AS3正向引物为5′-TGGGTCTGTGCAGTTAGA-3′，反向引物为5′-AGGGAGTCTAGGCCCCTTCT-3′；GAPDH正向引物为5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′，反向引物为5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′。

1.3.2细胞培养、分组及转染 鼻咽癌细胞CNE2采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素溶液的RPMI1640培养基培养，放置在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。24 h后更换培养基，72 h后传代。取对数生长期的细胞以3×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，根据是否转染si-RNA分为si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组。当细胞密度为30%～50%时，使用Lipofectamine2000试剂盒进行细胞转染。无血清培养基用于稀释100 pmol LncRNA MAGI2-AS3 siRNA和 NC siRNA，使得终浓度为50 nmol/L，然后混合并在室温下孵育5 min。与Lipofectamine 2000溶液混合，室温孵育20 min，加入细胞中。在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中孵育6～8 h后，更换新鲜培养基进一步培养48 h用于以下实验。采用RT-qPCR检测LncRNA MAGI2-AS3的表达,比较si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞转染效果。

1.3.3CCK8实验检测细胞放疗敏感性 将si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞以1×104个/孔接种到96孔板中，每组包括6个重复孔，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中培养。细胞贴壁后，分别采用0.0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 Gy的放射剂量辐射各组细胞。在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中继续培养48 h后，各细胞孔中加入10.0 μL CCK8试剂，在培养箱中孵育1 h后，通过酶标仪在450 nm 的激发波长下测量每个孔的A值。

1.3.4平板克隆实验检测细胞克隆形成能力 将si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞以500个/孔接种到6孔板中，每组包括3个重复孔，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中培养。细胞贴壁后，采用2.0 Gy的放射剂量辐射各组细胞，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中继续培养，并每隔48小时更换1次新鲜培养基。培养48 h，肉眼可见细胞克隆团形成时，终止细胞培养，PBS洗3次后，加入甲醇溶液固定10 min，弃掉甲醇溶液，加入结晶紫染色20 min，双蒸水清洗干燥后，扫描并计数各组细胞克隆团形成数目。

1.3.5流式细胞术检测细胞周期 将si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞以2×105个/孔接种到6孔板中，每组包括3个重复孔，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中培养。细胞贴壁后，采用2.0 Gy的放射剂量辐射各组细胞，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中继续培养48 h，终止细胞培养，采用胰酶消化、收集各组细胞，PBS洗3次后，加入细胞周期检测缓冲液500.0 μL重悬细胞，并加入50.0 μL的PI染液、12.5μL的RNase A试剂，混匀后，放置37 ℃中孵育30 min，采用流式细胞仪检测各组细胞周期。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡 将si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞以2×105个/孔接种到6孔板中，每组包括3个重复孔，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中培养。细胞贴壁后，采用2.0 Gy的放射剂量辐射各组细胞，放置在37 ℃、5%CO2加湿培养箱中继续培养48 h，终止细胞培养，采用无EDTA的胰酶消化、收集各组细胞，PBS洗3次后，加入细胞凋亡检测缓冲液500.0 μL重悬细胞，并加入5.0 μL Annexin V-FITC试剂和10.0 μL PI染液，混匀后放置室温中孵育30 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.3.7裸鼠成瘤实验检测细胞体内生长能力 BALB/c-nu雄性裸鼠分为鼠si-NC组和鼠si-LncRNA MAGI2-AS3组，每组6只。胰酶消化收集鼠si-NC组和鼠si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞，PBS洗3次后，以5×106个/只接种到裸鼠皮下。使用游标卡尺每周测量1次小鼠肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，按以下公式计算肿瘤体积：体积=(a×b)/2。当肿瘤体积约为50 mm3时，在连续 5 d内以每天2.0 Gy 的剂量向肿瘤施加总剂量为10.0 Gy 的放射线。继续饲养并测量肿瘤的体积，4周左右处死小鼠，将肿瘤解剖并称质量。

1.3.8Western blot试验检测细胞周期和凋亡蛋白表达 采用RIPA裂解液提取si-NC组和si-LncRNA MAGI2-AS3组细胞蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。将蛋白煮沸进行变性处理，将处理后的蛋白加入加样孔中，在10%分离凝胶中进行SDS-PAGE电泳约2 h，分离蛋白，以电湿转的方式将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜在室温下封闭1 h。洗膜后，加入兔cyclin D1单克隆抗体(稀释比例为1∶1 000，ab16663)、兔CDK4单克隆抗体(稀释比例为1∶1 000，ab108357)、兔活化的caspase3单克隆抗体孵育(稀释比例为1∶500，ab32150)、兔活化的caspase9单克隆抗体(稀释比例为1∶500，ab79202)，于4 ℃条件下孵育过夜。将膜洗涤并与HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)的二抗(稀释比例为1∶2 000，ab6721)在37 ℃下孵育 2 h。以GAPDH作为内参蛋白。由增强型化学发光系统检测，然后由凝胶成像系统处理和分析。

2 结 果

2.1LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌组织中表达上调 RT-qPCR结果显示，LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌组织中的表达为1.39±0.58，高于在癌旁组织中的表达(0.98±0.53)，差异有统计学意义(t=4.298，P<0.001)。

2.2LncRNA MAGI2-AS3表达与鼻咽癌患者放疗敏感性的关系 RT-qPCR结果显示，LncRNA MAGI2-AS3在放疗抵抗患者鼻咽癌组织中的表达为1.52±0.61，高于在放疗敏感患者鼻咽癌组织中的表达(1.23±0.51)，差异有统计学意义(t=2.164，P=0.034)。

2.3LncRNA MAGI2-AS3 siRNA转染鼻咽癌细胞的效果 RT-qPCR检测LncRNA MAGI2-AS3在si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞中的相对表达量为0.45±0.06，低于其在si-NC组鼻咽癌CNE2细胞中的相对表达量(1.00±0.04)，差异有统计学意义(t=12.626，P<0.001)。

2.4LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响 CCK8实验检测结果显示，与si-NC组相比，si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞放疗敏感性增加(P<0.05)。见图1。

注：与si-NC组相比，*P<0.05。

2.5LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞克隆形成能力的影响 经放射处理后，平板克隆实验检测结果显示，与si-NC组鼻咽癌CNE2细胞[克隆形成数(42.33±6.25)个]相比，si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞[克隆形成数(19.67±4.97)个]克隆形成能力降低(t=4.915，P=0.004)。见图2。

图2 LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞克隆形成能力的影响

2.6LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞周期的影响 经放射处理后，流式细胞实验检测结果显示，与si-NC组鼻咽癌CNE2细胞(G0/G1期细胞百分比为43.68%±2.16%)相比，si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞(G0/G1期细胞百分比为53.11%±2.52 %)周期阻滞在G0/G1期(t=4.921，P=0.004)。见图3。

注：与si-NC组相比，*P<0.05。

2.7LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞凋亡的影响 经放射处理后，流式细胞术检测结果显示，与si-NC组鼻咽癌CNE2细胞(细胞凋亡率为3.45%±1.53%)相比，si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞凋亡增加(细胞凋亡率为23.34%±4.67%)，差异有统计学意义(t=7.012，P=0.001)。见图4。

图4 LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞凋亡的影响

2.8LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞体内生长能力的影响 经放射处理后，裸鼠成瘤实验检测结果显示，与鼠si-NC组鼻咽癌CNE2细胞相比，鼠si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞成瘤体积减小(P<0.05)。见图5A。与鼠si-NC组鼻咽癌CNE2细胞成瘤体质量[(0.53±0.06)mg]相比，鼠si-LncRNA MAGI2-AS3组鼻咽癌CNE2细胞成瘤体质量减少[(0.29±0.02)mg]，差异有统计学意义(t=6.362，P=0.003)。见图5B。

注：A为成瘤体积比较；B为成瘤体质量比较；与si-NC组相比，*P<0.05。

2.9LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞周期蛋白和凋亡蛋白表达的影响 Western blot试验检测结果显示，与si-NC组相比，si-LncRNA MAGI2-AS3组cyclin D1、CDK4表达降低(P<0.05)，促进凋亡蛋白活化的caspase3、caspase9表达增加(P<0.05)。见图6。

图6 LncRNA MAGI2-AS3 siRNA对鼻咽癌细胞周期和凋亡蛋白表达的影响

3 讨 论

LncRNA为长度大于200 nt的非蛋白编码转录物，没有编码蛋白的能力，最初LncRNA被认为是转录过程中产生的无用序列，没有任何功能。然而，研究发现LncRNA在包括细胞凋亡、分化、侵袭等多种过程的调控中发挥作用，并且它们存在异质性，发挥的功能不同[11]。最近，LncRNA被鉴定为肿瘤发生和进展的关键因素，LncRNA在肿瘤中表达异常，并影响肿瘤细胞的恶性进展过程，包括上皮间质转化(EMT)、细胞侵袭、细胞生长、细胞耐药等，LncRNA可作为肿瘤生物标志物和抗肿瘤治疗的重要分子靶标[12]。

LncRNA在鼻咽癌发生、发展中的作用已被广泛研究，并可作为鼻咽癌检测和预后判断的生物标志物，以及抗肿瘤治疗靶点[13]。LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌中表达升高，并通过调节甘油磷酸酯二酯酶域5(GDPD5)导致鼻咽癌的进展和顺铂耐药性，以及通过调节SEC61易位Alpha1亚基(SEC61A1)促进鼻咽癌细胞的增殖和迁移能力提升[5]。LncRNA MAGI2-AS3在胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、食管癌等常见的恶性肿瘤中均有报道[6-8,14]，其中LncRNA MAGI2-AS3在食管癌组织和细胞中低表达，LncRNA MAGI2-AS3与Zeste同源2(EZH2)相互作用，下调HOXB7，从而促进细胞凋亡并抑制细胞增殖和放疗抵抗。鼻咽癌对电离辐射高度敏感，因此放疗是鼻咽癌患者治疗的重要手段，但是放疗抵抗是导致鼻咽癌患者预后不良的主要原因[2]。本研究首先检测鼻咽癌组织中LncRNA MAGI2-AS3的表达，结果显示LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌组织中表达上调，与CAO等[5]的研究结果一致。同时本研究发现，LncRNA MAGI2-AS3与鼻咽癌患者放疗抵抗有关，在放疗抵抗的鼻咽癌组织中LncRNA MAGI2-AS3的表达增加。而由于本研究收集的鼻咽癌样本量不多，后续会扩大样本量，分析LncRNA MAGI2-AS3的表达与鼻咽癌患者临床分期的关系。

本研究在细胞水平研究LncRNA MAGI2-AS3对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响，干扰LncRNA MAGI2-AS3的表达后，CCK8实验显示鼻咽癌细胞对放疗的敏感性增加，并且在放射线的作用下，干扰LncRNA MAGI2-AS3表达的鼻咽癌细胞克隆形成能力降低，以及裸鼠成瘤能力降低。这表明LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌放疗抵抗中发挥了重要作用，其作用机制还需进一步探讨。已经观察到干扰LncRNA MAGI2-AS3表达后，经放疗处理的鼻咽癌细胞的克隆形成能力，即单个细胞增殖能力降低。细胞周期失控的表现为细胞恶性增殖，在干预条件下诱导细胞周期阻滞，会导致细胞增殖能力降低，这也是放疗的重要机制[15]。本研究发现，在放疗作用下抑制LncRNA MAGI2-AS3的表达，细胞周期阻滞在G0/G1期。放疗治疗恶性肿瘤的另一重要机制是诱导靶细胞凋亡。细胞凋亡是一种生理现象，通过凋亡将不需要的细胞、受损细胞和衰老细胞处理掉，而对放疗抵抗的肿瘤细胞可能会出现细胞凋亡缺陷[16]。本研究发现，在放疗作用下抑制LncRNA MAGI2-AS3的表达，细胞凋亡增加。这提示LncRNA MAGI2-AS3可能通过调控细胞周期和凋亡促使鼻咽癌放疗抵抗。进一步检测发现，在放疗作用下，抑制LncRNA MAGI2-AS3的表达，鼻咽癌细胞中G0/G1期相关蛋白cyclin D1、CDK4[16]表达降低，促进凋亡蛋白活化的caspase3、caspase9[17]表达增加，表明LncRNA MAGI2-AS3可能通过调控细胞周期相关蛋白和凋亡蛋白促使鼻咽癌细胞放疗抵抗。

综上所述，LncRNA MAGI2-AS3在鼻咽癌组织中表达增加，与放疗抵抗有关，抑制LncRNA MAGI2-AS3的表达后鼻咽癌细胞对放疗的敏感性增加，其可能是通过调控细胞周期蛋白和凋亡蛋白发挥作用的。