血清羧肽酶N1和半乳糖凝集素-1在乳腺癌中的表达及临床意义*

张 媛，白 俊，曹 菲，孙 超，岳青芳

陕西省人民医院肿瘤内科,陕西西安 710000

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，全球每年新发病例达226万例，死亡例数达68万例[1]。乳腺癌的发生与遗传因素、环境因素及激素水平等有关[2]。目前乳腺癌发生的生物学机制尚不清楚，无有效的针对性防治措施，寻找乳腺癌血清肿瘤标志物有助于该病的早期诊断和早期治疗，改善乳腺癌患者预后[3]。目前临床上常用的肿瘤标志物包括糖类抗原(CA)153、癌胚抗原(CEA)及CA125等，但由于其在一些感染性疾病中水平也会升高，导致特异性不佳[4]。羧肽酶N1(CPN1)是一种血浆金属蛋白酶，属于肽酶M14家族成员，据报道，CPN1作为一种酶，参与循环中基质细胞衍生因子-1α的C端裂解，对造血系统、心血管功能和血管生成至关重要[5-6]。近年的研究发现，乳腺癌组织中CPN1表达升高，其表达水平能够反映患者临床预后情况，是一种新的肿瘤标志物[7]。半乳糖凝集素-1(Gal-1)为一种凝集素蛋白，编码基因定位于人类22q12染色体，是一种同源二聚体蛋白，包含两个β-半乳糖苷结合位点。研究表明，Gal-1可以与H型三磷酸鸟苷酶相互作用，促进细胞增殖和有丝分裂，参与细胞聚集、增殖、肿瘤诱导的血管生成和转移等生物学过程[8]。近年来发现，Gal-1在宫颈癌[9]、肾癌[10]等肿瘤组织中表达异常升高，并促进肿瘤的恶性进展。本研究通过检测血清CPN1、Gal-1在乳腺癌中的表达，探讨以上指标在乳腺癌中的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2017年1月至2019年1月本院收治的64例乳腺癌患者为研究对象(乳腺癌组)：年龄33～71岁，平均(53.20±6.10)岁；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期30例；肿瘤最大径：≥2 cm 35例，<2 cm 29例；组织分化程度：高分化19例，中低分化45例；淋巴结转移：转移42例，无转移22例。乳腺癌组纳入标准：(1)乳腺癌经病理学检查确诊。(2)初次诊治。(3)患者一般状况良好。排除标准：(1)合并其他器官恶性肿瘤。(2)合并严重的心、肺衰竭。(3)合并乳腺炎等良性疾病。将同期收治的42例乳腺良性肿瘤患者作为乳腺良性肿瘤组，将同期在本院体检的40例体检健康者作为健康对照组。乳腺良性肿瘤组：年龄34～71岁，平均(54.60±5.20)岁；均为乳腺纤维腺瘤。健康对照组：年龄32～73岁，平均(56.30±6.40)岁。各组年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核通过(审批号：SX20160814012)。

1.2方法 取各组研究对象清晨空腹静脉血4 mL，2 500 r/min离心15 min，取上层血清置于离心管，于-20 ℃保存。CPN1试剂盒购自上海瑞番公司，Gal-1试剂盒购自上海研启公司。酶联免疫吸附试验(ELISA)严格按说明书进行：设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入呈梯度浓度的标准品，样本孔加入样本，加入辣根过氧化物酶标记的抗体室温孵育1 h，加洗涤液洗涤5次，加入底物液A、B后室温避光孵育15 min，加终止液后测量450 nm波长处的A值。以不同稀释倍数标准品的浓度作为横坐标，以标准品450 nm处的A值为纵坐标，绘制标准曲线。将检测样品A450值代入曲线，计算对应的样品实际浓度。

2 结 果

2.1各组血清CPN1、Gal-1表达水平比较 各组血清CPN1、Gal-1表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。相比于乳腺良性肿瘤组及健康对照组，乳腺癌组血清CPN1、Gal-1表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照组与乳腺良性肿瘤组血清CPN1、Gal-1表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组血清CPN1、Gal-1表达水平比较

2.2乳腺癌组血清CPN1、Gal-1表达水平与临床病理特征的关系 乳腺癌组血清CPN1、Gal-1表达水平与临床分期、淋巴结转移及是否为三阴性乳腺癌有关(P<0.05),与年龄、分化程度、肿瘤最大径无关(P>0.05)。临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移及三阴性乳腺癌患者的血清CPN1、Gal-1表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移及非三阴性乳腺癌患者(P<0.05)。见表2。

表2 血清CPN1、Gal-1表达水平与临床病理特征的关系

2.3乳腺癌组血清CPN1、Gal-1表达水平之间的相关性 Pearson相关分析结果显示，乳腺癌患者血清CPN1表达水平与Gal-1呈正相关(r=0.486，P<0.001)。见图1。

图1 乳腺癌组血清CPN1、Gal-1表达水平相关性的散点图

2.4血清CPN1、Gal-1对乳腺癌的诊断效能 ROC曲线分析结果显示，血清CPN1、Gal-1单独及联合检测时，诊断乳腺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.708(95%CI：0.490～0.923)、0.725(95%CI：0.458～0.982、0.836(95%CI：0.688～0.963)，其中联合诊断效能更高，AUC及灵敏度、特异度均较各指标单独诊断有明显提升。见图2、表3。

图2 血清CPN1、Gal-1单项及联合检测诊断乳腺癌的ROC曲线

表3 血清CPN1、Gal-1单项及联合检测对乳腺癌的诊断效能

3 讨 论

近年来，乳腺癌的发病率呈逐年升高的趋势，目前乳腺癌已成为全球女性第一大癌症[11]。乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗及化疗等，但由于个体差异性较大，不同患者的预后差异较大[12]。深入研究乳腺癌的发生机制，寻找乳腺癌早期诊断及病情判断的肿瘤标志物具有重要意义。乳腺癌患者的血清肿瘤标志物需具有价格低廉、标本易取等优点，这将有利于乳腺癌的早期筛查、预后预测及治疗效果监测。乳腺癌的发生、发展与调控细胞增殖、凋亡及转移的基因突变有关，例如错配修复基因BRCA1等的突变可导致乳腺癌的发生[13]。

羧肽酶N(CPN)也称为精氨酸/赖氨酸羧肽酶或激肽酶Ⅰ，是锌金属蛋白酶家族的成员。CPN是由两个相同的催化亚基CPN1和两个调节亚基CPN2组成的四聚体，其中CPN1是主要功能亚基[14]。已有研究报道，乳腺癌组织中CPN1表达水平升高与患者不良预后有关，能够判断化疗的疗效[7]。然而，CPN1在乳腺癌患者血清中的表达情况尚不清楚。本研究中，乳腺癌患者血清CPN1表达水平显著升高，提示乳腺癌中CPN1表达上调。目前其表达上调的机制尚不清楚，可能与微小RNA对其的表达调控有关。研究发现，miRNA-409-3p能够通过抑制核转录因子LMO4的表达，进而抑制LMO4的靶基因CPN1的表达[15]，因此，乳腺癌中CPN1的表达水平升高可能与肿瘤中miRNA-409-3p表达下调有关[16]，但具体作用机制有待深入研究。

此外，本研究发现，乳腺癌患者血清中CPN1表达水平与临床分期、淋巴结转移及是否为三阴性乳腺癌有关，表明CPN1参与乳腺癌的进展。一项体外细胞实验表明，CPN1在乳腺癌细胞中表达升高能够促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，而降低CPN1表达后，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力显著受到抑制[17]。有研究报道，CPN1在几种特定类型的乳腺癌中表达水平升高，与健康对照者和其他非三阴性乳腺癌患者相比，三阴性乳腺癌患者CPN1 mRNA表达水平更高[18]，与本研究结果一致。有研究还显示，高CPN1表达水平的乳腺癌患者总体生存时间较短，预后较差[18]。因此，血清CPN1可能是辅助诊断乳腺癌新的肿瘤标志物。

Gal-1属于半乳糖苷结合蛋白家族成员，进化较为保守，能够识别β-半乳糖苷，通过与细胞表面糖偶联蛋白或脂质结合，介导细胞-细胞之间或细胞-细胞外成分之间的信号传递。研究表明，Gal-1在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中表达上调，通过参与免疫抑制、促血管生成和促进肿瘤转移，发挥促进肿瘤进展的作用[19]。本研究中，乳腺癌组患者血清Gal-1表达水平明显高于健康对照组和乳腺良性肿瘤组，提示Gal-1可能参与乳腺癌的发生。研究表明，乳腺癌组织中Gal-1表达水平升高，其通过结合E-选择素，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[20]。本研究发现，乳腺癌组血清Gal-1的表达水平与临床分期及淋巴结转移等有关，提示血清Gal-1的高表达促进了乳腺癌的进展。研究报道，肿瘤中Gal-1的表达能够促进1-磷酸鞘氨醇受体1的表达，促进肿瘤细胞上皮间质转化，使间质性标志物如N-钙黏素表达增加，进而促进肿瘤的远处转移[21]。还有研究发现，Gal-1能够激活肿瘤细胞中丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进p38的磷酸化，进而促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移[22]。本研究进一步分析发现，血清CPN1表达水平与Gal-1呈正相关(P<0.05)。研究发现，Gal-1能够通过促进肿瘤细胞分泌血管内皮细胞生长因子，促进肿瘤血管新生，而血管内皮细胞生长因子能够促进CPN1的表达[5,23]。因此，CPN1与Gal-1在乳腺癌中可能发挥协同促癌的作用。

理想的乳腺癌肿瘤标志物具有灵敏度高，器官特异性强等优点。研究表明，恶性肿瘤中的CPN1、Gal-1能够分泌到血清中，导致其血清水平升高，检测以上指标不仅有利于疾病的早期诊断，还可判断疾病的严重程度[18,24]。本研究中ROC曲线分析发现，血清CPN1、Gal-1联合检测对乳腺癌具有较高的诊断效能，并且灵敏度和特异度较高，提示联合检测有助于乳腺癌的早期诊断。

综上所述，乳腺癌患者血清CPN1、Gal-1表达水平升高，血清CPN1、Gal-1表达水平与临床分期及淋巴结转移等有关，二者的高表达可能促进了乳腺癌的进展。联合检测血清CPN1、Gal-1水平对乳腺癌具有较高的诊断价值，是新的、非侵入性早期诊断方法。然而，本研究为单中心回顾性研究，样本量有限，可能存在一定的误差，有待后续进行深入研究。