3株鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及特性鉴定

韩文龙，张雪梅,2，王小兰，于圣青

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽 230036）

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）病是家禽中主要的细菌性传染病之一，主要症状是以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和干酪性输卵管炎为特征的传染性败血症。除感染鸭外，RA还可以感染鸡、火鸡、鹅及其他禽类[1]。本病对1～8周龄的鸭易感，感染RA的病鸭精神沉郁，绿色腹泻，眼睛和鼻子有浆液性分泌物，部分呈现神经症状，死亡率高，且该病治疗成本高，对养鸭业造成较大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌的血清型众多而复杂，至今不同国家已报道了21种血清型[2-4]，其中血清1、2、6、10型是国内主要流行血清型[5-6]，且血清型间缺乏交叉保护，给鸭疫里默氏杆菌病的诊断与防控造成极大的困难。

OmpA蛋白家族是革兰氏阴性菌外膜蛋白中的一个保守的且最为丰富的结构蛋白，具有很强的免疫原性和反应原性，并且不同血清型RA的ompA基因具有较高的同源性，它的这一特性具有极高的研究价值，Hu等[7]以血清2型RA为基础构建OmpA缺失株Th4△OmpA，发现缺失株的毒力显著下降，血液载菌量显著低于野生株，证明OmpA是RA的毒力因子之一。本研究通过杂交瘤技术，成功制备3株能够稳定分泌抗RA OmpA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为进一步研制RA快速诊断试剂盒奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、实验动物及细胞株 RA血清1型分离株CH3、RA血清2型分离株NJ3、RA血清10型分离株HXb2[8]，大肠杆菌血清型O78菌株E937，大肠杆菌血清型O2菌株DE719，大肠杆菌血清型O1菌株APEC01[9]，均为本实验室保存菌株。鸡白痢菌株CVCC519，禽伤寒菌株CVCC 3384，巴氏杆菌株CVCC 493均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；骨髓瘤细胞（SP2/0）购自中国科学院细胞库；BALB/c小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司；鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白[10]保存于本实验室。

1.2 主要试剂及仪器 蛋白电泳仪、蛋白转印槽、细胞计数仪均购自Bio-Rad公司；二氧化碳培养箱、液氮罐均购自Thermo Fisher公司；生物安全柜购自美国LABCONCO公司；倒置显微镜购自Leica公司；超低温冰箱购自美国Nuair公司。小鼠单克隆抗体分型试剂盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP 购自Southern Biotech公司；蛋白质分子量标准购自Thermo Fisher公司；胎牛血清、青链霉素双抗购自Gibco公司；PRMI 1640购自Hyclone公司；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自Abcam公司；

1.3 动物免疫 将纯化后的OmpA蛋白与完全弗氏佐剂1∶1混合，经乳化器充分乳化，以100 μg的免疫剂量皮下多点免疫注射8周龄雌性BALB/c鼠，每隔两周，相同的免疫剂量，进行第二次和第三次加强免疫，第二、三次免疫用不完全弗氏佐剂乳化。第三次加强免疫后两周，眼眶后静脉丛采血并分离血清，间接ELISA法检测血清效价。选效价最高的小鼠第四次加强免疫，免疫原剂量是初次免疫的二倍且不使用免疫佐剂，72 h内进行细胞融合。

1.4 细胞融合、亚克隆及稳定性检测 将1×108个脾脏细胞与2.5×107个骨髓瘤细胞SP2/0混合，以pH8.0的50%PEG为融合剂，分装至96孔细胞培养板，每孔0.10～0.15 mL，然后37℃、5%CO2培养箱内培养。5 d后用HAT培养基换出一半培养基，7 d后更换HT培养基，观察杂交瘤细胞生长情况，待其生长至孔底面积的10%以上时，取细胞培养上清液测定抗体效价。以OmpA蛋白为包被抗原（1 μg/孔），以HRP标记的羊抗鼠IgG+IgM（H+L）作二抗，健康鼠血清作为阴性对照，根据抗体效价筛选出阳性反应的杂交瘤细胞。分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞使用有限稀释法亚克隆至阳性单克隆100%。将杂交瘤细胞传代培养10代，用间接ELISA法检测细胞上清液抗体水平，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

1.5 腹水制备及效价检测 BALB/c小鼠饲养至8周龄，腹腔注射灭菌液体石蜡致敏，0.3 mL/只。饲养一周后，将培养状态良好的杂交瘤细胞用RPMI 1640洗涤3次，计数后每只腹腔注射0.2 mL（1×106cell）。5 d后每日观察小鼠状态，若腹部明显膨大，用灭菌的16号针头收取腹水，收集的腹水离心除去杂质。间接ELISA法[11]测定效价，以OmpA蛋白（1 μg/孔）作为包被抗原，以梯度稀释的腹水作为一抗，以OmpA蛋白鼠抗血清作为阳性对照，以空白对照组鼠血清作为阴性对照，以HRP标记山羊抗鼠IgG作二抗。判定标准，小鼠腹水效价为实验组OD450（P）与阴性对照组OD450（N）的比值（P/N）不小于2.1的最大稀释倍数。

1.6 单克隆抗体亚型测定 根据小鼠单克隆抗体分型试剂盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP说明书提供的方法，鉴定3株单克隆抗体的亚型。

1.7 单克隆抗体的特异性鉴定 按文献报道 [12]进行检测。RA血清1型CH3、RA血清2型NJ3、RA血清10型HXb2菌株、巴氏杆菌菌株CVCC 493，分别转接TSA平板，将大肠杆菌血清型O78 E937、肠杆菌血清型O2 DE719、大肠杆菌血清型O1APEC01菌株、鸡白痢菌株CVCC519、禽伤寒菌株CVCC 3384，分别转接LB平板，培养至对数生长期，无菌PBS洗脱平板上的菌，4℃、6000 ×g离心5 min，重复洗涤3次，菌数调整至OD600为1.0，将菌液浓缩10倍，OmpA蛋白为阳性对照，诱导后大肠杆菌BL21全菌蛋白作为阴性对照，各取10 μL加入40 μL的5×loading-buffer，煮沸20 min，得到蛋白电泳样品。加样孔中加入等量的蛋白样品，恒压80 V直至loading-buffer泳至胶片底部，恒压120 V直至结束，转印到硝酸纤维素膜（NC膜），5%脱脂乳PBS封闭转印后的NC膜，将腹水1∶5000稀释作为一抗，将HRP标记羊抗鼠IgG抗体1∶20 000稀释作为二抗，检测单克隆抗体的特异性。玻片凝集法检测按文献[12]进行，取RA血清1型CH3、RA血清2型NJ3、RA血清10型HXb2、大肠杆菌血清型O78 E937、大肠杆菌血清型O2 DE719、大肠杆菌血清型O1 APEC01、鸡白痢菌株CVCC519、禽伤寒菌株CVCC 3384、巴氏杆菌株CVCC 493的单个菌落作为诊断抗原，均匀涂布于5 μL单克隆抗体2D5、2A6或4H8腹水中，2 min内观察凝集反应结果检测单克隆抗体的特异性。

1.8 单克隆抗体的染色体分析 采用秋水仙素法[13]进行单克隆抗体染色体分析，当细胞生长至孔底面积85%时，用0.2 μg/mL秋水仙素的1640培养基分别处理杂交瘤细胞，37℃、5%CO2培养箱恒温培养6 h，无菌PBS洗脱细胞，1000 ×g离心5 min弃上清液；用预热37℃的0.075 mol/L KCl溶液重悬细胞，37℃水浴15 min；加入新配置的固定液（甲醇：乙酸=3:1（V/V））混匀，1000 ×g离心5 min后弃上清液，用固定液重悬细胞，室温静置25 min，1000×g离心5 min后弃上清液，重复一次，加入适量固定液，4℃密闭静置过夜，1000 ×g离心5 min弃上清液，加入1 mL固定液重悬；固定好的细胞滴加至载玻片（冰水预处理），铺平，自然晾干，火焰固定；10×100倍镜下观察染色体数目。选择分散、无重叠、无缺失的染色体进行观察，每个杂交瘤细胞计数100个中期核细胞，算出杂交瘤细胞的染色体数目。

2 结果

2.1 单克隆抗体细胞株的建立及稳定性检测 OmpA超免后的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经间接ELISA法筛选出阳性融合细胞，成功融合的杂交瘤细胞经3次亚克隆后获得3株杂交瘤细胞，命名为2D5、2A6、4H8。图1可以看出1-10代2D5、2A6、4H8细胞上清液效价基本一致，说明这3株杂交瘤细胞均能够稳定分泌抗体。

图1 3株杂交瘤细胞稳定性Fig.1 Cell stability of three hybridomas

2.2 单克隆抗体效价检测 用间接ELISA方法检测单克隆抗体腹水效价，2D5、2A6、4H8腹水的效价均为1∶2 048 000。

2.3 单克隆抗体亚型测定 利用小鼠单克隆抗体分型试剂盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP，按说明书进行检测，抗RA OmpA 单克隆抗体2D5、2A6和4H8均为IgG2a亚型。

2.4 单克隆抗体的特异性鉴定 由Western blot结果可知，3株腹水均与OmpA蛋白特异性反应，与诱导后BL21全菌蛋白无反应，与RA株CH3、NJ3、HXb2特异性反应，与沙门菌、大肠杆菌及巴氏杆菌不反应（图2），表明研制的3株单克隆抗体具有很强的种属特异性。由玻片凝集结果可知，3株腹水均与RA株CH3、NJ3和HXb2发生特异性反应，与沙门菌、大肠杆菌及巴氏杆菌不反应（图3），同样表明研制的3株单克隆抗体具有很强的种属特异性。

图2 Western blot检测单克隆抗体的特异性结果Fig.2 Western blot of the specificity of monoclonal antibodies

图3 单克隆抗体玻片凝集结果Fig.3 The slide agglutination of monoclonal antibodies

2.5 单克隆抗体的染色体分析 通过显微镜观察，细胞染色体形态一致，分布均匀，图4所示，杂交瘤细胞100倍镜下染色体的分布，每个杂交瘤细胞计数100个，杂交瘤细胞2D5的平均染色体对数是78；杂交瘤细胞2A6的平均染色体对数是84；杂交瘤细胞4H8的平均染色体对数是85，说明鼠骨髓瘤细胞与小鼠B细胞融合成功，成功得到这3株单克隆抗体。

图4 杂交瘤细胞染色体分析Fig.4 Chromosome analysis of hybrid tumor cells

3 讨论

1975年英国科学家Kohler和Milstein建立单克隆抗体技术，因此获得了1984年诺贝尔奖。单克隆抗体（monoclonal antibody）技术利用B细胞产生特异性抗体的和骨髓瘤细胞能无限增值的能力，融合剂的作用下二者结合，得到既能分泌特异性抗体又具有无限增殖能力的杂交瘤细胞，并以此产生特异性抗体的技术。单克隆抗体具有特异性强、多样性、效价高、定向性结合、交叉反应少等特点；此外，单克隆抗体不需要免疫动物，在体外能够快速、大批量生产。随着单克隆技术的不断改进和发展，单克隆抗体技术在很多科学领域得到广泛应用，尤其在疫病诊断方面，Hou等[14]利用抗RA GroEL的单克隆抗体（1G2F10）标记在胶体金颗粒上作为金标抗体，建立一种诊断RA的免疫胶体金检测试纸条。Yu等[15]利用单克隆抗体A12D3作为金标抗体，制备一种免疫胶体金快速检测试纸条，用于诊断鸭坦布苏病毒。Ma等[16]利用重组蛋白E2和过氧化物酶标记的单克隆抗体（mAb G5），建立了一种竞争的化学发光免疫分析法，用于快速准确地检测猪血清中E2特异性抗体。

本研究以OmpA蛋白为免疫原免疫小鼠，将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合后获得3株抗RA OmpA的单克隆抗体，命名为2D5、2A6、4H8。Western blot结果表明3株单克隆抗体均与RA血清1、2、10型菌株发生特异性反应，而与其他禽类致病菌（鸡白痢、禽伤寒、禽巴氏杆菌，大肠杆菌）无反应性，表明3株单克隆抗体均具有RA特异性。单克隆抗体亚类分析结果表明，3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为IgG2a亚类。病原进入宿主后，血液中主要的抗体成分是IgG，占血液总量的75%，具有ADCC及吞噬增强作用[17]，可用于疾病的早期诊断及致病机理的研究，对鸭疫里默氏杆菌病的诊断和防治具有深远意义。

OmpA蛋白家族是革兰氏阴性菌外膜蛋白中的一个最为丰富的结构蛋白，是决定细菌致病性的重要因素，具有很强的免疫原性和反应原性，不同来源的ompA基因具有较高的同源性，它的这一特性具有极高的研究价值[7]。本研究结果表明，3株单克隆抗体与RA的OmpA蛋白区域出现阳性反应条带，表明制备的3株单克隆抗体是RA的OmpA抗原表位，具有RA特异性。玻片凝集结果同样证明，3株单克隆抗体的RA特异性，3株单克隆抗体均与RA血清1、2、10型菌株发生特异性反应，与其他禽类菌株无反应性，因此3株单克隆抗体均可以作为诊断RA的靶标。

目前，临床上诊断RA的方法主要是经典的细菌分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法。细菌分离鉴定耗时长达几日，繁琐且工作量大；血清学方法不需要特殊的仪器且能够短时间内完成检测，但检测的工作量大且灵敏度低；分子生物学诊断方法特异性强、灵敏性高，但需要精密的仪器、专业的操作人员，因此需要建立一种快速、灵敏、特异性强，能用于临床的检测方法。单克隆抗体凭借特异性强、灵敏度高、易于生产等特点，已经应用于多种检测试剂盒的研制，本研究制备的3株单克隆抗体效价高、特异性强，可用于RA快速诊断试剂盒的研制。