桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的鉴定及其在低温胁迫下的表达分析*

郝兰兰，马乃膺，张仲兴，李小兰，王 鸿,2

(1.甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 林果花卉研究所，甘肃 兰州 730070)

锌指蛋白(zinc-finger proteins，ZFPs)是含有通过结合Zn2+而存在的一类具有指状结构的模体，它对植物基因的表达调节、细胞分化、胚胎发育和植物逆境生理调节等都具有重要意义[1]。按照半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)的位置和数量可将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6 和C8 等10 种不同类型[2-3]。C2H2 型锌指蛋白由2 个Cys 和2 个His 残基围绕1 个Zn2+组成，构成了一种独特的三维空间结构，包括1 个反向互补的β 折叠结构和1 个α 螺旋结构[4-5]。Q 型C2H2-ZFPs 作为重要的C2H2 型锌指蛋白，广泛分布于真核生物中，其锌指结构域(CX2-4CX3FX3QALGGHX3-5H)内含有高度保守的QALGGH 基序，为植物所特有[6-9]。目前，已有多个物种Q 型C2H2-ZFPs 的相关研究，且在拟南芥[10]、杨树[11]、水稻[12]和小麦[13]中其均被证明参与多种生物过程，包括植物生长和器官发育以及对逆境的反应与防御[14]。Q 型C2H2 型锌指蛋白在低温胁迫中也发挥着重要作用。OsMSR15在水稻受低温和干旱胁迫时上调，其过表达可显著增强水稻对逆境的耐受性[15]；ZHANG 等[16]研究表明：SICZFP1基因过表达能明显增强转基因拟南芥和水稻的耐低温性；分离自大豆cDNA 文库的C2H2 型锌指蛋白基因SCOF-1已被证实与大豆的低温耐受性密切相关，并可被低温和ABA诱导表达，其编码产物与SGBF-1 蛋白相互作用，调控下游耐冷基因(cold regulated gene，COR)表达，以增强耐低温能力[17]；此外，也有研究指出低温条件下矮牵牛ZPT2-2 和ZPT2-3 的表达量均会明显上升以应对低温胁迫[18-19]。可见，Q 型C2H2 锌指蛋白在植物抵抗低温胁迫中起重要作用，然而在桃中尚未有研究报道。

桃(Prunus persicaL.)是蔷薇科重要落叶小乔木，因其肉质鲜美和营养丰富，素有“寿桃”和“仙桃”的美称。中国桃的主要种植区位于温带和亚热带，该区域易发生周期性冻害，严重限制其产量与品质，因此，挖掘抗寒基因对提高桃的耐低温性能具有重要意义。随着桃全基因组数据[20]的公布，本研究初步鉴定了桃Q 型C2H2 锌指蛋白家族成员并预测其部分功能，为进一步研究桃C2H2基因对低温胁迫的响应提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

2021 年7 月下旬，在甘肃省农业科学院桃园采集12 枝粗细相近、长短相同、朝北直立生长的丁家坝李光桃(P.persica nectarina) 1 年生带叶枝条。将枝条随机分为4 组，用保鲜袋密封，于4 ℃培养箱中进行低温诱导。在4 ℃处理0、2、6 和12 h 时随机选取1 组枝条，采集叶片作为试验材料，每组3 个枝条分别作为3 个重复，立即用液氮冷冻，在-80 ℃下保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的鉴定

从拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org/)[21]下载拟南芥Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的蛋白序列，以其作为模板构建文库，在桃基因组数据库中(https://www.rosaceae.org/)[22][Prunus persica Whole Genome Assembly v2.0 &Annotation v2.1 (v2.0.a1)] 进行隐马尔科夫模型(hidden markov model，HMM)和BLASTP 算法搜索，获得桃C2H2候选基因。进一步运用Pfam (https://pfam.xfam.org/search)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)软件进行筛选，去除其中不含Q 型C2H2 锌指蛋白特定结构域的基因，最终获得桃C2H2 家族成员。

1.2.2 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族理化性质和染色体定位分析

利用EXPaSy (http://web.expasy.org/computepi/)在线工具对桃Q 型C2H2 锌指蛋白的相对分子质量、氨基酸大小和等电点等理化性质进行分析；采用WoLFPSORT 网站(https://wolfpsort.hgc.jp/)在线预测其亚细胞定位状况和二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)；利用TBtools 软件测定桃Q 型C2H2 基因家族成员染色体分布，并进行可视化；从桃基因组中提取C2H2 型锌指蛋白家族全部成员的所在位置信息，利用MapGene2 软件将其家族成员定位到桃染色体上。

1.2.3 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员进化关系和基因结构分析

使用MEGA-X 软件分析基因家族的系统发育关系，以邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树；通过MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)预测蛋白保守基序，motif 的最大预测参数设置为14；将桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员的进化树和保守基序利用TBtools 软件合并并可视化。

1.2.4 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员顺式作用元件分析

利用在线网站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因上游启动子区2 000 bp 序列进行顺式作用元件分析，并将结果用TBtools 可视化。

1.2.5 实时荧光定量PCR 分析

根据顺式作用元件(含低温响应元件LTR)以及国内外学者对Q 型C2H2 家族成员在其他物种上的研究，选取16 个极有可能响应低温胁迫的该家族成员进行荧光定量PCR 验证。在上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成C2H2 锌指蛋白家族基因特异性引物序列(表1)。cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)并参照说明书进行。采用SYBR Green 荧光染料法进行荧光定量PCR 反应，其中Actin作为内参基因。反应程序为：95 ℃变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共40 个循环。试验进行3 次生物学重复。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

2 结果与分析

2.1 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的鉴定和蛋白质理化性质

在桃基因组中鉴定Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员46 个，并按照其在染色体上的位置顺序命名为PpC2H2-1(Prupe.1G034100)～PpC2H2-46(Prupe.8G228000)。桃Q 型C2H2 基因家族的蛋白理化性质分析(表2)显示：氨基酸数量介于155～607 之间，理论等电点(pI)介于4.70～9.57，蛋白质分子质量介于17.118 7～65.857 11 ku。亚细胞结构定位预测显示：PpC2H2s基因主要分布于细胞核，仅有少数成员存在于细胞质和叶绿体中。

表2 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族蛋白质理化性质Tab.2 Physicochemical properties of Q-C2H2 zinc finger protein gene family proteins in peach

2.2 桃和拟南芥Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族系统进化树分析

为研究桃和拟南芥Q 型C2H2 锌指蛋白基因之间的进化关系，对104 个Q 型C2H2 锌指蛋白(拟南芥58 个和桃46 个)的氨基酸序列进行系统进化分析，结果(图1)显示：根据序列相似性，可将PpC2H2 和ATs 的蛋白序列聚为16 个亚组(A～P)。PpC2H2s 在16 个亚组上均有分布，其中P 亚组分布最多，为7 个；D 和M 亚组包含成员数量最少，各含1 个。每1 个亚组中最少包含1 个拟南芥C2H2 锌指蛋白转录因子家族成员。

图1 拟南芥 (AT) 和桃 (Pp) Q 型C2H2 进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Q-type C2H2 in Arabidopsis thaliana (AT) and peach (Pp)

2.3 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员的基因结构及保守基序

由图2a 可知：46 个PpC2H2 可聚为7 个亚族(Ⅰ～Ⅶ)。由图2 b 可知：35 个成员无内含子，6 个成员含1 个内含子，5 个成员含有2 个或多个内含子；其中，亚族Ⅱ和Ⅲ中的成员均无内含子，Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ亚族中均有2 个成员含内含子，Ⅳ亚族中含有内含子的成员分别为PpC2H2-39、PpC2H2-06 和PpC2H2-24。由C2H2 成员的保守基序(图2c)及其中主要的2 个motif (图3)可知：除PpC2H2-26 外，其余45 个成员均含有motif1，说明motif1 为C2H2 蛋白的高度保守基序；且同一进化支的保守基序具有相似性，可能具有相同的功能，而不同进化支内保守基序数量和类型差异较大，该结果进一步支持了桃Q 型C2H2锌指蛋白基因家族系统进化树的分析结果。

图2 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员的进化关系、基因结构及motif 分析Fig.2 Evolutionary relationship,gene structure and motif analysis of Q-type C2H2 zinc finger protein gene family members in peach

图3 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族主要保守基序Fig.3 Main conserved motif of Q-type C2H2 zinc finger protein gene family in peach

2.4 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的启动子顺式作用元件

由图4 可知：桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族包含多种植物激素顺式调控元件，如：脱落酸响应元件 (ABRE)、水杨酸响应元件 (TCA)和光响应元件 (G-box)等，其中还具有低温响应元件(LTR)，猜测C2H2 型转录因子在桃抗低温胁迫中起重要作用。

图4 桃Q 型C2H2 锌指蛋白家族成员启动子上游2 000 bp 的部分重要顺式作用元件Fig.4 Some important cis-acting elements in the upstream 2 000 bp sequences of peach Q-C2H2 zinc finger protein family member

2.5 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族的染色体定位

由图5 可知：Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员不均匀地分布于桃的8 条染色体上，其中，分布于1 号和6 号染色体上的基因数量最多，各具有10 个基因；分布在4 号染色体上的基因数量最少，仅含有1 个基因。此外，共鉴定出9 对串联重复基因，其中在1、2、6、8 号染色体上有2 对串联重复基因，7 号染色体上有1 对串联重复基因。

图5 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因的染色体分布Fig.5 Chromosomal distribution of C2H2 zinc finger protein gene in peach

2.6 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族成员的实时荧光定量PCR 分析

qRT-PCR 分析结果(图6)表明：4 ℃低温诱导时，16 个基因均上调，但表达模式不同。PpC2H2-03、PpC2H2-05、PpC2H2-12、PpC2H2-14、PpC2H2-15、PpC2H2-17、PpC2H2-18、PpC2H2-21、PpC2H2-24、PpC2H2-27、PpC2H2-28、PpC2H2-43、PpC2H2-44和PpC2H2-45的表达量均随胁迫时间延长整体呈升高的趋势，在12 h 达到峰值；PpC2H2-30和PpC2H2-34在2 h 达到峰值，之后有所降低，但均显著高于0 h。因此，推测C2H2 转录因子家族可能在桃抗寒过程中发挥重要功能。

图6 桃Q 型C2H2 锌指蛋白基因在低温胁迫下的表达Fig.6 Expression of Q-type C2H2 zinc finger protein gene in peach under low temperature stress

3 讨论

Q 型C2H2 锌指蛋白基因家族是目前研究最为详尽的锌指家族之一，生物学功能多样[23-25]。它不仅能与DNA、RNA 相互作用，还可与蛋白结合[26]，参与植物的生长发育过程，包括叶的发生[27]、花器官发育[28]、种子萌发[29]、小穗发育[30]、激素信号转导以及非生物应激反应[31]。迄今为止，已从多个物种中鉴定出Q 型C2H2 锌指转录因子，如矮牵牛[32]、拟南芥[10]、水稻[12]、杨树[11]、番茄[33]、大豆[34]、马铃薯[35]和甘蓝[28]等，但在桃中尚未见相关报道。

本研究从桃基因组中筛选得到46 个Q 型C2H2 成员，并对其进行了生物学信息分析。蛋白质理化特性决定亚细胞定位、配体结合和分子结构等特性，这些特性往往与蛋白质的生物学功能有关[36]。本研究发现：Q 型C2H2 锌指蛋白家族成员多为碱性蛋白，分子质量介于17.12～65.86 ku。此外，大量研究表明：亚细胞定位是确定序列生物学功能的重要线索，特别是与基因表达调控相关的序列[37]。本研究预测发现该家族成员主要存在于细胞核中，仅有少数分布于线粒体、液泡和叶绿体中，这与井建玲等[38]对木薯的研究结果一致。保守结构域表明：每个成员最少包含1 个C2H2 锌指结构域，其中包含1 个植物特异性QALGGH 基序，在C2H2 转录因子的蛋白质结合DNA 序列中起重要作用[39-40]。系统进化树结果表明：该家族蛋白被聚为16 个亚组(A～P)，并且聚类在同一分支中的基因具有功能多样性。染色体定位分析发现：Q 型C2H2 锌指蛋白不均匀地分布在桃的8 条染色体上，说明C2H2 锌指蛋白转录因子家族成员发挥着广泛的作用。

低温是制约作物产量与品质的重要逆境因子，据统计：全世界每年因低温造成的农作物损失高达数千亿美元[41]。转录因子能与启动子区域中的顺式作用元件结合，激活低温胁迫下响应基因COR的表达，从而响应逆境生理[42]。Q 型C2H2 锌指蛋白转录因子广泛存在于真核生物中且具有多种功能，已被研究报道响应低温胁迫，如：ZFP245 的过表达可增强水稻对低温、干旱和氧化胁迫的耐受性[43]。本研究对Q 型C2H2 蛋白启动子上游2 000 bp 序列分析表明其存在低温响应元件(LTR)，推测该家族成员可能在桃应对低温胁迫中具有重要作用。此外，基因的表达模式可为了解其功能提供重要线索。qRT-PCR 发现：低温胁迫下，16 个Q 型C2H2 家族成员均显著上调，进一步暗示Q 型C2H2 可能参与桃响应低温胁迫。

4 结论

本研究采用生物信息学方法在桃中鉴定了46 个PpC2H2基因，可聚为16 个亚组，且不均匀地分布在桃的8 条染色体上。低温胁迫下，16 个Q型C2H2 家族成员表达均为上调，且以PpC2H2-18最为显著，提示Q 型C2H2 可能与桃抗低温性相关，这为进一步研究该家族成员对低温胁迫的作用提供了参考依据。