高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清免疫及抗氧化指标的影响*

2022-09-22安雅雯杨晓东郭绍乾高智雄石彩霞高爱武王海荣

云南农业大学学报(自然科学) 2022年5期

安雅雯，杨晓东，郭绍乾，高智雄，石彩霞，高爱武，王海荣

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018)

在中国饲料端完全禁抗以及因饲喂高精料频发反刍动物营养代谢病的背景下，如何有效解决由禁抗所带来的各种问题，并在高精饲粮条件下保持动物健康，是饲料行业和营养调控的重点问题。苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)作为一种中草药添加剂，广泛分布于中国西北和西亚等荒漠的湿润地区[1]，其富含生物碱、多糖、类固醇和黄酮等多种营养成分[2-3]，其中，生物碱是主要的活性物质。有研究发现：苦豆子提取物可增强小鼠体内的细胞免疫，并起到明显的抗炎作用[4]。李巨银等[5]研究表明：复方氧化苦参碱—黄芪多糖高、中和低剂量组均能提高鸡血清中IL-2 和IFN-γ 的质量浓度，从而增强动物的体液免疫能力。尚智等[6]研究表明：苦参碱可抑制小鼠脾淋巴细胞增殖及IL-2 释放，也可抑制腹腔巨噬细胞释放IL-1，以进一步抑制自身免疫反应。JIA 等[7]研究表明：苦豆子可显著改善由葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎，抑制IL-1β 以及TGF-β1 表达，上调IL-10 表达。牛晓珊等[8]给高脂血症鹌鹑饲喂复方苦豆子后，降低了其血清中的MDA 含量，升高了SOD 活性，证明苦豆子具有一定的抗氧化功效。可见，苦豆子及其提取物具有抗炎、抗氧化并调节动物机体免疫的功能。与非反刍动物相比，反刍动物的瘤胃微生态环境和饲粮结构存在差异。课题组前期研究发现：随着饲粮精粗比的增加，添加微量苦豆子可增强蒙古羔羊的免疫调节和抗氧化能力[9]，推测在高精饲粮条件下添加苦豆子饲喂育肥羔羊可有效减少炎症反应，进一步调节羔羊机体健康。本研究在课题组前期研究的基础上，探究高精料饲粮中添加不同剂量苦豆子对育肥羔羊血清免疫及抗氧化功能的影响，以期为苦豆子作为中草药添加剂在反刍动物营养中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲粮组成

本试验采用单因素完全随机试验设计，选取32 只3 月龄健康、体质量为(25.73±2.17) kg 的杜蒙杂交公羔统一进行免疫和驱虫，随机分为4 组，每组8 只。其中，对照组饲喂基础饲粮；T1组饲喂基础饲粮+0.1%苦豆子；T2组饲喂基础饲粮+0.3%苦豆子；T3组饲喂基础饲粮+0.5%苦豆子。试验预试期15 d，正试期60 d。试验饲粮设计参照中国羊常用饲料成分及营养价值(NY/T 816—2004)，饲粮配方及营养成分见表1。苦豆子来源及使用方法：市售，粉碎过筛后以相应添加比例拌入精补料中进行饲喂，添加剂量根据课题组前期体外试验[9]确定。通过酸性染料分光光度法测得苦豆子中总生物碱(主要活性物质)含量为5.75%，回收率达95.95%。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

1.2 饲养管理

饲养试验在内蒙古农业大学教学牧场开展，试验前将羊舍进行彻底消毒，试验期间，试验羊只按组间体质量差异不显著原则随机分到1.5 m×1 m×1 m 的铁制羊笼中单笼饲养，羊笼安装独立食槽和饮水装置，羊舍温度和湿度分别保持在15～20 ℃和50%～60%，自然通风。试验羊只每天08：00 和18：00 各饲喂1 次，自由采食和饮水。羊舍定期打扫和消毒。

1.3 样品采集与测定指标

试验期间每天记录每只羊的采食量，在正式试验后的第 0、30 和60 天晨饲前对试验羊空腹称量并于颈静脉采血制备血清，-80 ℃冷冻保存待测。血清免疫细胞分子、免疫球蛋白、促炎细胞因子和抑炎细胞因子均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)测定；谷胱甘肽过氧化物酶、总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽、丙二醛、过氧化物歧化酶和一氧化氮的测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

试验仪器：紫外分光光度计(型号：UV-1780，日本岛津)和酶标仪(型号：SYNERGY H11，美国BioTek)。

1.4 数据分析

试验采用SAS 9.2 中的GLM 模型进行方差分析；采用Duncan 氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。试验结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清免疫功能的影响

2.1.1 对血清免疫细胞分子的影响

由表2 可知：在高精饲粮中添加不同剂量苦豆子后，T1组第30 天血清中的CD3+水平显著高于其他3 组(P＜0.05)；T2组第30 天血清中的CD4+水平显著高于对照和T3组(P＜0.05)；T1和T2组第60 天血清中的CD4+水平极显著高于对照组(P＜0.01)，CD4+/CD8+的比值显著高于对照组(P＜0.05)；其他各指标各组间均无显著差异(P＞0.05)。

表2 高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清免疫细胞分子的影响Tab.2 Effects of Sophora alopecuroides on the serum immune cell molecules of Dumont lamb pg/mL

2.1.2 对血清免疫球蛋白的影响

由表3 可知：在高精饲粮中添加不同剂量苦豆子后，T2和T3组第30 天血清中的IgA 质量浓度显著低于对照组(P＜0.05)；T2组第60 天血清中IgM 和IgG 的质量浓度极显著高于对照和T1组(P＜0.01)；其他各指标各组间均无显著差异(P＞0.05)。3 个试验组第30 天血清中的IgA 质量浓度极显著高于第60 天血清(P＜0.01)；T1组第30 天血清中的IgG 质量浓度也极显著高于第60天血清(P＜0.01)；其余各指标各组内差异均不显著(P＞0.05)。

2.1.3 对血清炎性细胞因子的影响

由表4 可知：在高精料饲粮中添加不同剂量苦豆子后，T1和T2组第60 天血清中的IL-6 质量浓度极显著低于对照组(P＜0.01)；T2和T3组第30 天血清中的TNF-α 质量浓度显著低于对照组(P＜0.05)；T2组第60 天血清中IL-10、IL-22和TGF-β 的质量浓度均显著或极显著高于其他3 组(P＜0.05 或P＜0.01)；3 个试验组第30 天血清中的IFN 质量浓度显著高于对照组(P＜0.05)；其他各指标各组间差异不显著(P＞0.05)。T2组第30 天血清中的TGF-β 质量浓度显著低于第60 天血清(P＜0.05)；而T3组第30 天血清中的IFN 质量浓度则极显著高于第60 天血清(P＜0.01)；其余各指标各组内差异不显著(P＞0.05)。

表4 高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清炎性细胞因子的影响Tab.4 Effects of S.alopecuroides on the serum inflammatory cytokines of Dumont lamb pg/mL

2.2 饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清抗氧化指标的影响

由表5 可知：在高精饲粮中添加不同剂量苦豆子后，3 个试验组第30 天血清中的SOD 活性极显著高于对照组(P＜0.01)，且试验天数增加到第60 天时，3 个试验组血清中的SOD 活性仍显著高于对照组(P＜0.05)，血清中MDA 的含量则呈现相反的变化趋势；3 个试验组第60 天血清中的NO 浓度极显著低于对照组(P＜0.01)；其他各指标各组间差异不显著(P＞0.05)。T1组第30 天血清中的MDA 含量极显著高于第60 天血清(P＜0.01)；T3组第30 天血清中的GSH-Px 质量浓度显著高于第60 天血清(P＜0.05)；其余各指标各组内差异不显著(P＞0.05)。

表5 高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清抗氧化指标的影响Tab.5 Effects of S.alopecuroides on the serum antioxidant index of Dumont lamb

3 讨论

在实际生产中，养殖户通常仅从饲粮成本及动物的增质量效果考量饲料添加剂的优劣，而生长性能则是最直观的量化参数。有研究表明：中草药添加剂能明显促进动物生长[10-11]；本课题组前期研究[12]也发现：高精料中添加微量苦豆子可提高羔羊第0～30 天的阶段日增质量，说明苦豆子能激发高精料下羔羊的生长潜力。血液指标的代谢产物可反映动物机体全身或局部代谢变化和正常的生理功能，通过分析血清相关代谢产物，可快速评估动物机体的营养健康状况。

3.1 高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清免疫功能的影响

CD3+免疫细胞分子仅存在于T 细胞膜表面并参与T 细胞的信号转导，CD4+和CD8+免疫细胞分子分布在辅助性T 细胞及细胞毒性T 细胞膜表面。当动物机体出现炎症时，可根据CD4+的数量快速启动机体免疫系统抵御病原菌，因此，当动物血清CD4+/CD8+的比值升高时，说明动物机体的免疫力增强。ZHOU 等[13]研究表明：经2,4,6-三硝基苯磺酸诱导，结肠炎大鼠的结肠和外周血清中CD4+的数量明显降低，口服苦豆子总生物碱后大鼠的CD4+数量反而升高，说明苦豆子总生物碱可有效改善由2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎。朱国峰[14]研究表明：3%的苦豆籽粕可显著提高35 日龄AA 肉鸡血清中CD3+和CD4+的数量，说明苦豆籽粕可促进血液中T 淋巴细胞增殖，有利于免疫细胞因子更好地发挥免疫调节作用。本研究中T1组第30 天血清中的CD3+数量显著升高，T1和T2组第60 天血清中的CD4+数量极显著升高，说明饲粮中添加0.1%和0.3%苦豆子可提高动物机体免疫功能，这与前人的研究结果一致。推测其原因可能是苦豆子中的多种活性成分能够显著提高动物的细胞免疫，从而有效缓解高精饲粮条件下羔羊的炎症反应，并维持动物健康生长。

免疫球蛋白在血液中的含量可以反映动物机体的免疫功能。IgG 具有结合病毒和清除抗原的作用，IgA 在动物组织局部黏膜免疫中起重要作用，IgM 是血液中主要的抗感染免疫分子。杨春雷等[15]在蛋鸡饲粮中添加复合中草药可不同程度地提高蛋鸡血清中IgA、IgM 和IgG 的含量；JIN 等[16]研究也表明：经乳酸菌发酵的复方中草药组断奶仔猪血清中IgA 和IgM 的含量显著升高；WANG 等[17]以益生菌和复方中草药混合发酵的浓缩液饲喂泽西黄牛的研究表明：中草药对动物机体免疫功能具有明显的促进作用。本研究中，T2组第60 天血清中IgM 和IgG 的质量浓度均显著升高，但IgA 的含量却显著降低，且3 个试验组IgA 的质量浓度随着试验时间的增加呈现极显著降低的变化趋势，这与前人的研究结果不同。分析其原因可能是试验组羔羊的黏膜免疫屏障在试验第30 天时发挥主要作用，并促进B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白，进而提高了羔羊血清中的IgA 质量浓度；当试验进行到第60 天时，羔羊机体的黏膜免疫将不再起主要作用，血清IgA的质量浓度则又恢复到正常水平，其具体机理有待进一步验证。

IL-2 是评价机体免疫能力的重要指标；IL-6 既能促进免疫细胞的增殖和分化，又能刺激肝脏产生急性期蛋白而促进动物感染，IL-1 与IL-6 可协同促进T 细胞增殖，而TNF-α 可促进巨噬细胞合成并分泌IL-1，进而促进炎症反应的发生。王超等[18]研究表明：在小鼠饲粮中添加氧化苦参碱可明显降低IL-1β 和IL-6 的表达量；YE等[19]研究表明：苦豆碱可抑制由脂多糖诱导的巨噬细胞促炎细胞因子IL-6 和TNF-α 表达；JIA 等[7]研究发现：苦豆子组可显著下调IL-1β基因的表达，并证明苦豆子对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎具有保护作用；张晓松等[20]研究也发现：与大肠湿热症模型组相比，苦豆草组中IL-1β、IL-2、IL-6 和TNF-α 指标均显著降低，说明苦豆草可以缓解大肠湿热症大鼠体内的炎症反应并对其有较好的治疗效果。本研究中，试验组羔羊血清中的IL-1 质量浓度低于对照组，但IL-2 质量浓度高于对照组，这与黄志坚等[21]的研究结果相似。有关促炎细胞因子的研究各异，推测可能是由于动物品种、添加剂量、活性成分及饲养管理等因素所致。此外，本研究条件下，T1和T2组第60 天血清中的IL-6 质量浓度均极显著降低，试验组第30 天血清中的TNF-α 质量浓度均低于对照组，可见，苦豆子可抑制某些炎症因子的形成和释放，从而降低促炎细胞因子的数量以提高羔羊的免疫功能，使羔羊机体的炎症反应得以缓解，其机理仍需进一步研究。

IL-10 是一种抑炎因子，参与炎症和免疫反应；IL-22 是一种信号分子，当动物机体发生炎症或感染时，IL-22 会对组织发出预警；TGF-β不仅参与炎症反应和组织修复，而且对细胞的分化和免疫有重要的调节作用。SHOICHIRO 等[22]给小鼠灌服青黛发现：随着灌服剂量的增加，IL-10 和IL-22 在淋巴细胞中的表达随之增加，证明青黛可改善由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎。桑秀秀等[23]在肝脏受损的小鼠饲粮中添加氧化苦参碱，发现其可显著提高小鼠血清中IL-10 的表达量。本研究中，T2组第60 天血清中的IL-10和IL-22 质量浓度显著升高，说明在饲喂高精料导致瘤胃过酸的情况下，0.3%的苦豆子能促进T 细胞和B 细胞分泌抑炎细胞因子，发挥免疫抑制作用以提高其免疫功能，并缓解羔羊机体的炎症反应，其具体抗炎机制有待进一步验证。LIU等[24]研究发现：香附总皂甙可抑制抗原诱导性关节炎小鼠脾细胞TGF-β、IFN-γ、IL-22 和IL-6 的产生；CHEN 等[25]研究表明：茵栀黄呈剂量依赖抑制由葡萄球菌肠毒素B 诱导的人单核巨噬细胞产生IFN-γ 和TNF-α。这2 种中草药均可作为免疫抑制剂降低抗体免疫反应，以达到治疗免疫疾病的效果；但也有研究发现芍药苷可抑制IFNγ 和IL-17 的表达，从而增强小鼠系统性白色念珠菌的感染[26]。本研究中，试验组第30 天血清中的IFN 质量浓度显著高于对照组，且T2组第60 天血清中的TGF-β 质量浓度极显著升高，这与和李巨银等[5]和郭小会[27]的研究结果一致。说明试验组动物体内存在一定数量的抗炎细胞因子，能够促进细胞免疫，有效缓解高精饲粮带来的危害，从而使羔羊更好地生长，这可能与苦豆子中的活性物质能够促进免疫细胞分泌一定数量的抗炎因子以提高羔羊机体的免疫修复功能有关。

3.2 高精饲粮中添加苦豆子对杜蒙羔羊血清抗氧化指标的影响

T-AOC 表示动物应对外界氧化应激的总体表现，SOD 是清除机体自由基的关键酶，MDA 含量体现机体细胞和组织的氧化水平，NO 是动物机体内氧化应激的标志物，GSH-Px 质量浓度与机体清除自由基的能力呈正相关。HAO 等[28]研究表明：随着育肥羔羊饲粮中黄芪粉的增加，其血清中T-AOC 和T-SOD 活性呈线性增加；当黄芪粉的添加量达到10 g/kg 时，MDA 含量最低，由此证明10 g/kg 是其最适添加量。ZHANG 等[29]给热应激奶牛每天饲喂220 g 复方中草药，增加了奶牛血清中T-AOC、SOD 和GSH-Px 的活性，显著降低了MDA 含量。CHEN 等[30]研究发现：五味子和芍药的提取物可提高哮喘小鼠血清中SOD和GSH-Px 的活性，从而提高抗氧化能力。郭坤[31]将中草药与γ-氨基丁酸联合使用添加到黄牛饲粮中发现：试验组黄牛血清中的MDA 含量显著低于对照组，明显降低了黄牛血清中过氧化物的含量。本研究中，3 个试验组第30 天和第60天血清中的SOD 活性均高于对照组，而血清中的MDA 和NO 含量则呈相反的变化趋势，说明日粮中添加适量苦豆子可有效清除羔羊体内的自由基和过氧化物，从而增强动物机体的抗氧化能力，这与前人的研究结果一致。然而，羔羊血清中T-AOC 活性和GSH-Px 质量浓度在各组间无显著差异，这可能与中草药作用缓慢、添加剂量及羊只个体差异有关，其机理有待进一步验证。