基于金属有机骨架材料的电化学DNA传感器在分析检测领域的应用进展

江 兰 ,杭永正 ,邹立娜 ,潘洪志 ,荣胜忠* ,马宏坤

(1.牡丹江医学院 公共卫生学院,牡丹江 157011;2.牡丹江医学院附属红旗医院,牡丹江 157011;3.上海健康医学院 协同科研中心,上海 201318)

核酸、生物分子和金属离子等检测物质的分析方法包括聚合酶链式反应法[1]、高效液相色谱法[2]、酶联免疫吸附法[3]等。然而,这些传统方法存在样品前处理相对繁琐、检测仪器成本高、需要熟练操作人员等问题,很难实现实时、快速和现场检测[4]。

电化学DNA 传感器是将DNA 分子作为识别元件或检测对象,通过换能器将DNA 分子特异性识别中产生的敏感信号转化为电化学信号,以此实现一个或多个目标分子的定性或定量检测[5-6],具有灵敏度高、检测成本低、特异性强以及便携性好等诸多优点,已广泛应用于分析检测领域[7-8]。

电化学DNA 传感器的性能与界面修饰材料密切相关。金属有机骨架材料(MOFs)是由金属簇与有机配体通过配位键形成的一种多孔材料,具有比表面积大、金属活性中心丰富和易修饰等诸多优点[9-10],已经初步用于电化学DNA 传感器的构建,并用于肿瘤标志物、抗生素及重金属等的灵敏、准确检测,引起学者的广泛关注。为此,本工作综述了电化学DNA 传感器的DNA 探针固定方法及信号物质,重点介绍了基于MOFs的电化学DNA 传感器在分析检测领域的应用进展[11-14]。

1 电化学DNA传感器的DNA探针固定方法

1.1 吸附法

吸附法是通过DNA 探针中带负电荷磷酸骨架与带正电荷电极之间的静电作用,将DNA 探针固定在电极表面的一种方法[15],分为直接吸附法与间接吸附法。直接吸附法是将一定量捕获探针滴加在修饰电极表面,直接经物理作用吸附[16];间接吸附法是在一定电压下通过计时电流法将DNA 探针固定在电极表面[2]。吸附法简单灵活,易操作,无需任何修饰,对DNA 探针损伤小,电极可重复使用,但是吸附法也存在DNA 探针固定不牢固的缺陷,这会使DNA 探针在高盐溶液中容易从电极表面脱落,因此采用该方法时对检测环境的要求较高[17]。

1.2 共价键合法

共价键合法是通过DNA 探针的功能基团(如氨基、磷酸基)与电极表面修饰的功能基团(如氨基、羧基、羟基)之间的共价结合,将DNA 探针固定在电极表面的一种方法[18]。ARIFFIN 等[19]采用金纳米粒子(Au NPs)修饰丝网印刷电极(SPE)表面,然后将氨基化空心二氧化硅球沉积到Au NPs修饰的SPE(Au NPs/SPE)表面,利用戊二醛连接DNA 探针,再用磷酸钾缓冲液冲洗,以去除未共价结合的DNA 探针。与吸附法相比,共价键合法固定DNA探针更加牢固与稳定,有利于提高DNA 探针的灵活性,进而提高分子杂交的效率。

1.3 自组装

自组装是利用电极表面的修饰物与DNA 探针之间形成的热力学稳定、高度有序的单层分子膜将DNA 探针固定在电极表面的一种方法[20]。自组装主要有两种情况:一是利用含有氨基、羟基等活性基团的硫化物、二硫化物在金电极或金修饰电极表面形成自组装膜,再将DNA 探针固定在电极表面,如SU 等[21]将硫醇化DNA 探针固定在Au NPs＠二硫化钼(MoS2)薄膜修饰的电极表面,用于捕获目标分子miRNA-21(miRNA 为微小RNA),构建了基于Au NPs＠MoS2复合材料的电化学DNA 传感器;二是对DNA 探针进行修饰,使之携带巯基(－SH)或硫原子,再将修饰后的DNA 探针自组装在金电极表面,如MA 等[22]将－SH 修饰的DNA 探针通过自组装形成单分子膜(SAM),用MOFs的骨架结构保护DNA SAM,使用单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、发夹DNA 和四面体纳米结构DNA 等不同的DNA 探针构建了相应的电化学DNA 传感器。自组装SAM 可以使电极表面形成结构紧密、组织完整的分子层,DNA 探针紧密结合在电极表面,稳定性和结合力更强,进而可以使DNA 探针与目标识别物牢固结合。但是自组装方法存在操作复杂、成本较高等不足。

2 电化学DNA传感器的信号物质

2.1 亚甲基蓝

亚甲基蓝(MB),化学式为C16H18Cl N3S,是一类带有芳香杂环结构的物质,可以特异性识别ssDNA 或dsDNA。许永强[23]将5′-SH 修饰的ssDNA固定在金电极上,以MB 作为杂交指示剂,构建电化学DNA 传感器来特异性检测碱基错配的ssDNA。王存等[24]将MB 封装在生物金属有机骨架材料(bio-MOF)中作为信号标签,当目标物含量持续升高时,电极表面引入的信标复合物Au NPs-MB＠bio-MOF数量增加,信号响应值增大。BAO等[25]将MB 嵌入氨基功能化的MOFs(UiO-66-NH2)孔内,通过酰胺反应连接可编程组装的锁定DNA(L-DNA),并以其作为信号标签,当目标物存在时,触发缺口内切酶,导致产生两条链(S1 与S2),S1 与S2 作为刺激物可以参与MB＠DNA/MOFs上的链置换反应,使L-DNA 发夹结构打开以释放MB,再加入L-DNA 的互补链使S1与S2重新游离到反应体系中以实现信号放大。

2.2 二茂铁

二茂铁(Fc),化学式为Fe(C5H5)2,属于金属有机配合物,其化学性质稳定、热稳定性高,在构建电化学传感器过程中常被用作信号物质。SHEN等[26]采用Fc和Cu-MOFs同时作为信号物质,并借助phi29 DNA 聚合酶和切口核酸内切酶进行二次循环,大量捕获的探针降低了Fc的原始信号,但发夹探针3/Au NPs/Cu-MOFs信号探针与捕获探针杂交后Cu-MOFs的信号逐渐增强,因此通过测量Cu-MOFs和Fc的峰值电流比构建了一种灵敏、高效的比率电化学方法来检测脂多糖。DENG 等[27]将Fc标记的信号探针和MB修饰的内参比探针结合在一个发夹结构的DNA 上,开发了一种基于双信号修饰的发夹结构DNA 比率探针,实现了对黏蛋白的高效检测。

2.3 硫堇

硫堇,分子式为C14H13N3O2S,是一种吩噻嗪类染料,由于稳定性好、电子转移能力强,常被用作信号物质。YU 等[28]以聚乙烯亚胺作为黏结剂,将硫堇与Ce-MOFs相结合,Ce-MOFs可以电催化硫堇,在凝血酶存在情况下,Ce-MOFs对硫堇的电催化能力进一步增强,从而增强电流,基于此构建了一种可以检测凝血酶的电化学DNA 传感器。WANG等[29]基于Co/Fe-MOFs复合物可以电催化硫堇放大电化学信号的特点,构建了一种检测赭曲霉毒素A 的电化学DNA 传感器。

3 基于MOFs的电化学DNA传感器在分析检测领域的应用

电化学DNA 传感器界面材料的选择直接影响检测的灵敏度及稳定性。MOFs具有孔隙率高、比表面积大、孔径可调、热稳定性强、催化性能好、易功能化等诸多优点,其特殊的结构和性质使MOFs比常规材料更具有优势。在构建电化学DNA 传感器过程中,MOFs的多孔结构、大的比表面积可以使DNA 探针牢固地固定在电极表面,避免DNA 探针受外界环境因素的影响[30]。MOFs作为一种催化材料,可以间接电催化硫堇、MB、Fc等信号物质,进而放大检测信号。因此,基于MOFs 的电化学DNA 传感器广泛用于肿瘤标志物、抗生素以及重金属的灵敏、准确检测。

3.1 肿瘤标志物的检测

3.1.1 端粒酶

端粒酶是一种由DNA 与蛋白质组成的核糖核蛋白复合体,是乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤的生物标志物[31-32]。

DONG 等[33]将MB 标记的发夹DNA 与端粒酶引物(TP)形成的复合物(MB-HPs-TP)通过Au－S键固定在电极表面,当反应体系中存在端粒酶和脱氧核糖核苷三磷酸复合物时,发夹DNA 打开,MB远离电极表面使产生的电流降低,随后向反应体系中加入Au＠Ce MOFs-cDNA,互补DNA(cDNA)能与TP 的延伸段杂交固定在电极表面,Au＠Ce MOFs-cDNA 可以电催化对苯二酚(HQ),从而产生HQ 的氧化峰。基于此,构建了一种比率电化学DNA 生物传感器,实现了端粒酶的检测,线性范围为2×102～2×106cells·m L－1,检出限为27 cells·m L－1。

WANG 等[34]在PCN-224(一种MOFs)上原位修饰银纳米粒子(Ag NPs)形成Ag NPs/PCN-224,然后采用链霉亲和素(SA)的识别部分对Ag NPs/PCN-224进行生物功能化修饰,并设计了一种含有SA 适配体的发夹结构DNA 以用于信号转导。当端粒酶存在时,端粒酶可以拉长发夹结构DNA 中的引物以取代部分茎链,从而导致发夹结构DNA中的SA 适配体形成开放结构。由于与核酸适配体的特异性相互作用,含有SA 识别部分的Ag NPs/PCN-224会与发夹结构DNA 中开放的SA 适配体结合附着在电极表面,Ag NPs/PCN-224 中的Ag NPs在0.072 V 处产生电化学信号,进而实现了端粒酶的检测,线性范围为1.0×10－7～1.0×10－1IU·L－1,检出限为5.4×10－8IU·L－1。

3.1.2 miRNA-21和miRNA-126

miRNA 是一种长度为19～39 kb的内源性非编码RNA。目前为止,miRNA-21 与miRNA-126是研究较多的miRNA,二者可以作为膀胱癌、直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生物标志物[35-36]。

MA 等[37]制备了含有硫堇的MOFs衍生的Fe-N-C-硫堇以及Fe3O4＠Au NPs,并将二者依次修饰在磁性玻碳电极表面,此时Fe-N-C 与Fe3O4＠Au NPs共同催化硫堇的电还原过程可产生一个原始电流;再通过Au－S键将－SH 功能化的发夹探针1 固定在Au NPs＠Fe3O4表面,然后滴加miRNA-21,当miRNA-21存在时,会触发催化发夹组装反应,进而提高传感器的灵敏度;然后再滴加导电性差的SiO2纳米球修饰的发夹探针2,此时SiO2的存在会使原始电流降低。基于miRNA-21 的浓度与信号电流差值之间的良好线性关系实现了miRNA-21的检测,线性范围为1 fmol·L－1～10 nmol·L－1,检出限为0.63 fmol·L－1。

HU 等[38]制备了一种新型双金属 MOFs(Co Ni-MOFs),然后通过氢键、π-π堆叠和范德华力的联合作用,将与miRNA-126碱基互补的DNA 探针牢固固定在CoNi-MOFs上。由于DNA 探针可以与miRNA-126 的碱基互补结合,进而实现了miRNA-126 的灵敏检测,线性范围为1 fmol·L－1～10 nmol·L－1,检出限低至0.14 fmol·L－1。

3.1.3 癌胚抗原

癌胚抗原(CEA)是一种膜结合糖蛋白,与疾病复发风险增加和患者预后不良有关,是肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的生物标志物[39]。

LI等[40]将制备了含有多巴胺(PDA)、Au NPs的八面体Fe-MOFs 复合材料(PDA＠Au＠Fe-MOFs),通过1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺偶联剂活化PDA＠Au＠Fe-MOFs 中的羧基(－COOH)。丰富的－COOH在多孔PDA＠Au＠Fe-MOFs表面可以链接更多氨基化修饰的适配体,进而可以氧化还原PDA,并加速电子转移以实现双重信号放大。基于PDA＠Au＠Fe-MOFs 复合材料构建了电化学DNA 传感器以用于CEA 的检测,线性范围为1 fg·m L－1～1μg·m L－1,检出限为0.33 fg·m L－1。

3.2 抗生素的检测

3.2.1 土霉素和卡那霉素

CHEN 等[41]采用UiO-66-NH2包裹金属离子(Cd2＋或Pb2＋),并通过Cd2＋或Pb2＋与适配体之间形成的金属离子＠氨基配位键将适配体固定在UiO-66-NH2上,同时在磁珠上固定抗单链抗体(anti-ssDNA,作为分离抗体),当反应体系中出现目标物时,anti-ssDNA 与目标物竞争性结合适配体,使适配体从磁珠上分离。此外,核酸外切酶水解适配体使目标物重新游离到反应体系中,使信号放大,实现了土霉素和卡那霉素的同时检测,线性范围为0.5 pmol·L－1～50 nmol·L－1,检出限分别为0.18 pmol·L－1和0.15 pmol·L－1。

3.2.2 氯霉素

WANG 等[42]制备了中空纳米盒(Pt Pd＠Ni-Co HNBs)与二烯丙基二甲基氯化铵功能化石墨烯(PDDA-Gr)的复合材料(PDDA-Gr/PtPd＠Ni-Co HNBs),然后通过Pt－S键、Pd－S键在PDDAGr/PtPd＠Ni-Co HNBs 上固定DNA 链,并采用UiO-66封装MB链接捕获DNA 作为捕获探针,在Exo III辅助循环扩增策略下,当氯霉素存在时,dsDNA解离,互补链释放,基于适配体和氯霉素之间的高亲和力,互补链结合到发夹DNA 末端形成另一种dsDNA 结构,触发新的循环,导致最终样本中出现触发DNA 与捕获探针杂交,实现信号放大。基于此,开发了一种电化学DNA 传感器,用于氯霉素的灵敏检测,线性范围为10 fmol·L－1～10 nmol·L－1,检出限为0.985 fmol·L－1。

3.2.3 博来霉素

HE 等[43]制备了UiO-66-NH2,并利用UiO-66-NH2修饰电极表面。通过酰胺反应将磁珠与末端修饰Fc-DNAs信号探针的发夹探针2相结合,当Fe2＋存在时,Fe2＋会与博来霉素结合形成“博来霉素-Fe(Ⅱ)”复合物,进而可以切割发夹探针1来释放触发序列,触发序列在反应体系中能激活Zn2＋依赖性脱氧核糖核酸酶(DNAzyme),从而使大量Fc-DNAs信号探针从磁珠上固定的发夹探针2中释放出来,释放的Fc-DNAs吸附在UiO-66-NH2修饰的电极表面以放大电信号。基于此,构建了一种灵敏的电化学DNA 传感器并用于测定博来霉素,线性范围为5～2 000 pmol·L－1,检出限为4 pmol·L－1。

3.3 重金属离子的检测

3.3.1 Hg2＋

ZHANG 等[44]将Au NPs修饰到电极表面并通过Au－S 键将DNA2 固定至其表面,再采用Cu-MOFs负载Au NPs复合物(Cu-MOFs/Au),通过Au－S 键对DNA1 进行标记以形成DNA1/Cu-MOFs/Au,并作为信号探针。当Hg2＋存在时,Hg2＋会激活发夹DNA2,并通过T-Hg2＋-T 配位化学键在DNA1和DNA2 之间形成T-T 错配,进而构建了一种灵敏地检测乳制品中Hg2＋的电化学DNA 传感器,线性范围为10 fmol·L－1～100 nmol·L－1,检出限为4.8 fmol·L－1。

3.3.2 Pb2＋

YU 等[45]采用还原氧化石墨烯-四亚乙基戊胺-Au NPs(r GO-TEPA-Au)复合材料修饰电极,再通过Au-NH2将SA 固定在r GO-TEPA-Au表面,然后滴加生物素标记的底物DNA 链和Pb2＋-特异性DNAzyme,在 Pb2＋的存在 下,Pb2＋-特异性DNAzyme激活切割底物DNA 链,从而产生新的ssDNA。同时制备了铂、钯掺杂的铁-有机骨架材料(Pd-Pt NPs＠Fe-MOFs)作为电催化剂,并将巯基化的发夹DNA(HP)通过共价键合法固定在Pd-Pt NPs＠Fe-MOFs上,然后利用HP 与ssDNA 的互补链杂交将Pd-Pt NPs＠Fe-MOFs结合到电极表面催化H2O2以实现信号放大。基于此,构建了间接检测水样中Pb2＋的电化学DNA 传感器,线性范围为0.005～1 000 nmol·L－1,检出限为2 pmol·L－1。

3.4 其他物质的检测

3.4.1 凝血酶

XIE 等[46]将MoS2与1-胺丙基-3-甲基咪唑氯盐(IL-NH2)修饰的Au NPs(Au NPs＠IL-MoS2)复合材料作为电极修饰材料,然后通过Au－S键将硫醇化适配体的三维支架 DNA 纳米四面体(3D NTH)固定在Au NPs＠IL-MoS2表面,随后依次加入凝血酶、通过EDC 和NHS 功能化修饰的Au NPs＠Fe-MIL-88(MIL代表莱瓦希尔骨架材料,是一类MOFs)结合cDNA 而形成的Au NPs＠Fe-MIL-88＠cDNA,并作为信号探针,3D NTH 中的适配体、Au NPs＠Fe-MIL-88＠cDNA 的cDNA 与凝血酶特异性结合,检测底液中[Fe(CN)6]3－/4－([Fe(CN)6]3－与[Fe(CN)6]4－的混合物)的信号并使之保持稳定,而Au NPs＠Fe-MIL-88＠cDNA 的信号则随凝血酶浓度的升高而增强。基于此,构建了比率电化学DNA 传感器,实现了凝血酶的检测,线性范围为0.298～29.8 pmol·L－1,检出限为59.6 fmol·L－1。

3.4.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇

WEN 等[47]通过三水硝酸铜和聚乙烯吡咯烷酮制备了多功能氮掺杂的铜金属有机骨架材料(NCu-MOF),该材料不仅可以作为信号探针,还可以通过氨基与Cu的相互作用将脱氧雪腐镰刀菌烯醇的适配体固定在N-Cu-MOF表面。基于此,建立了一种用于快速、灵敏测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的简易电化学DNA 传感器,线性范围为0.02～20 ng·m L－1,检出限为0.008 ng·m L－1。

3.4.3 赭曲霉毒素A

QIU 等[48]采用溶剂热法合成UiO-66,通过Au－S键将硫代化支撑序列(TSS)固定在金电极表面,再利用Zr4＋与磷酸盐基团(－PO43－)的特异协同作用,将赭曲霉毒素A 的适配体与TSS 进行杂交,通过Zr-O-P配位键将高稳定的UiO-66原位移植到赭曲霉毒素A 适配体的末端。随后,Zr-O-P配位键将大量带有－PO43－的MB标记探针组装在UiO-66表面,产生强烈电化学响应,当赭曲霉毒素A 存在时,它可以与TSS 竞争性结合,使UiO-66封装的5′-PO43－与3′-MB 双标记序列从传感器表面分离,从而降低电化学信号。基于此,建立了一个快速、灵敏检测赭曲霉毒素A 的电化学DNA 传感器,线性范围为0.1 fmol·L－1～2.0μmol·L－1,检出限为0.079 fmol·L－1。

3.4.4 mec A 和nuc基 因

DAI等[49]合成了双金属沸石咪唑骨架衍生的氮掺杂多孔碳以及UiO-66-NH2,并将二者依次滴加在玻碳电极表面,再通过酰胺键将羧基化靶ssDNA 偶联到UiO-66-NH2纳米载体上,并将MB 和表柔比星(EP)分别封装在UiO-66-NH2的孔内,然后加入对应靶ssDNA 的互补链,形成dsDNA 以包封住MB和EP,当两个目标DNA 都存在时,mec A和nuc基因与相应c DNA 完全杂交使MB和EP被释放,产生两个电流。基于此,构建了一种可以同时检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的mec A 和nuc基因的电化学DNA 传感器,线性范围均为5×10－15～1×10－10mol· L－1,检出限 分别为3.7 fmol·L－1和1.6 fmol·L－1。

3.4.5 香兰素

SUN 等[50]利用多孔结构超导电炭黑/Fc双掺MOFs(Fc-KB/ZIF-8)修饰电极,再原位电沉积Au NPs,并通过Au－S键将香兰素5′-SH 修饰的适配体固定在Fc-KB/ZIF-8＠Au NPs上。当香兰素存在时,香兰素可以与适配体结合,使其峰值电流(IVan,作为响应信号)强度增加,ZIF-8掺入的Fc峰值电流(IFc,作为参考信号)强度略有变化。基于IVan/IFc的比率响应构建了比率电化学适配体传感器,用于检测香兰素,线性范围为10 nmol·L－1～0.2 mmol·L－1,检出限为3 nmol·L－1。

4 总结与展望

本工作综述了基于MOFs的电化学DNA 传感器在分析检测各领域的应用进展,低成本、便携、宽线性范围等优点使之成为传统分析检测各领域方法的有效替代方法。未来基于MOFs的电化学DNA传感器在分析检测领域应侧重以下几个方面:电化学DNA 传感器的检测分析在准确度和灵敏度方面目前仍然存在挑战,应致力于研究MOFs复合材料修饰于传感平台或信号放大策略,进而提高检测灵敏度,降低检出限;不断提高MOFs的耐酸碱、热腐蚀能力,合理优化MOFs孔径设计,并与其他通信技术相结合,如打造可移动传感器,可以通过平板电脑和智能手机等通信工具与电化学传感器相组合来构建;注重发挥MOFs的优势,可与电化学DNA 传感器结合制作出大批量成本低、便捷、灵敏度高、实用性高的传感器;电化学DNA 技术与聚合酶链式反应、气相色谱等技术相结合,将应用范围拓宽至活体和在线实时分析等领域。综上所述,结构的高可变性及其可用于DNA 传感器构建的易用性使MOFs可以在分析检测领域中广泛应用。