有氧运动通过上调Dhcr24 改善H2O2 诱导的心肌细胞凋亡机制研究

董艾艾 陈 严 周建妹

心肌梗死是心力衰竭的重要诱因之一，每年死亡率接近5%，发病率不断上升[1]。心肌梗死后的运动训练有利于患者康复、提高生活质量，有助于预防梗死后的并发症，找到心肌梗死后运动康复的有效靶向分子非常重要[2]。24-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr24）是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性氧化还原酶家族的成员。Dhcr24 作为一种多功能蛋白质，具有胆固醇合成和抗凋亡活性[3]。心肌细胞凋亡是心肌细胞损伤的重要病理生理机制[4]。研究证明，Dhcr24 可显著抑制氧化应激和缺氧诱导的心肌细胞凋亡和心肌梗死[5]。在此背景下，本研究通过H2O2建立心肌细胞凋亡模型[6]，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）在运动后被激活[7-9]，通过AMPK 激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）来模拟心肌细胞的运动效果，研究Dhcr24 在有氧运动改善心肌梗死后心肌细胞功能中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 大鼠心肌细胞系H9C2（批号RDCL-012）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；DMEM 培养基（批号11965118）、胎牛血清（批号10100147）购自美国Gibco 公司；H2O2（批号88597）购自美国Sigma 公司；AICAR（批号2627-69-2）购自美国Selleck Chemicals 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司；One-Step TUNEL 凋亡试剂盒（批号C1088）、RIPA 蛋白裂解液（批号P0013C）、ECL 化学发光试剂盒（批号P0018AFT）购自上海碧云天生物技术公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号20190222）购自美国Thermo 公司；Dhcr24（批号ab137845）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（批号ab182858）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）（批号ab32503）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号ab8245）抗体购自Abcam 公司；Trizol（批 号15596018）购自美国Invitrogen 公司；cDNA 合成试剂盒（批号01286165）购自美国Thermo 公司；SYBR Premix Ex Taq ⅡPCR 试剂盒（批号RR820A）购自日本TAKARA 公司。

1.2 主要仪器 高速冷冻离心机（Thermo Fisher，型号：Fresco 17）、1300 系列Ⅱ级A2 型生物安全柜（Thermo Fisher，型号：1379）、CO2培养箱（Thermo Fisher，型号：BB150）、荧光定量PCR 仪（罗氏，型号：LightCycler480Ⅱ）、荧光倒置显微镜（尼康，型号：TiS）。

1.3 细胞培养与处理 H9C2 细胞培养在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、10 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基中，细胞在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。为了构建细胞凋亡模型，取对数期细胞接种至96 孔板中，通过100 μmol 的H2O2处理细胞4 h[6]。通过AMPK 激动剂AICAR（1 mmol）模拟H9C2 细胞的运动效应[7]。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞处理后通过0.05%胰蛋白酶将细胞消化为单细胞悬液，1000 r/min离心5 min 后加入200 μL 结合缓冲液重悬细胞，滴加Annexin V（10 μg/mL）和PI（10 μg/mL），避光孵育15 min，然后通过流式细胞仪分检测细胞凋亡情况。

1.5 TUNEL 检测细胞凋亡 通过一步法TUNEL 凋亡试剂盒检测细胞凋亡。细胞（1×105/孔）接种至玻璃盖玻片上，通过4%甲醛固定30 min、0.3% Triton X-100 透化10 min。玻片通过dUTP 和TDT 酶在37 ℃加湿箱中标记1 h，通过抗荧光淬灭封膜剂进行封膜，通过荧光显微镜观察阳性粒子。

1.6 蛋白免疫印迹检测细胞Dhcr24、Bcl-2、Bax 表达水平 细胞处理后，通过1% PMSF 的RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白，并通过BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，等量上样（30 μg）。经SDSPAGE 电泳，转至PVDF 膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗Dhcr24（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、GAPDH（1∶1000），4 ℃下孵育过夜，洗膜后加入HRP-羊抗兔二抗（1∶10000），室温下孵育2 h。通过ECL 化学发光显色对待测物进行分析。

1.7 RT-qPCR 检测细胞Dhcr24 mRNA 表达水平[10]使用Trizol 从H9C2 细胞中提取总RNA，通过cDNA 合成试剂盒纯化提取的RNA 并进行逆转录。通过SYBR Premix Ex Taq Ⅱ PCR 试剂盒进行qPCR 分析，采用2-ΔΔCt计算相对表达水平。Dhcr24 mRNA 引物序列：F：5'-CCGTCCATCAGTGGTCCTTC-3'；R：5'-GGTGATTCTGCCTTCCCACA-3'。引物委托生工生物工程有限公司合成。

1.8 统计学方法 通过统计软件Graphpad 8.0 对数据进行分析，所有符合正态分布数据以均数±标准差（）表示，两两比较通过t-test 检验分析，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2诱导心肌细胞凋亡 结果显示，与对照组比较，H2O2处理的心肌细胞凋亡水平显著升高[（20.75±1.28）%比（5.21±0.34）%，P＜0.05]（见图1A、B）。Western blot 结果显示，H2O2组抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平显著降低，促凋亡蛋白Bax 表达水平显著升高（见图1C）。上述结果表明，心肌细胞凋亡的体外模型构建成功。

图1 H2O2 诱导心肌细胞凋亡

2.2 H2O2诱导的心肌细胞Dhcr24 表达水平降低在H2O2诱导心肌细胞凋亡的体外模型中，通过Western blot 检测Dhcr24 的蛋白质表达水平，发现Dhcr24 在H2O2组显著降低（见图2A）。同时，对Dhcr24 的mRNA 水平进行检测，RT-qPCR 的结果[（0.56±0.07）比（1.00±0.15），P＜0.05]与Western blot结果趋势一致，见图2B。

图2 H2O2 诱导心肌细胞Dhcr24 表达水平降低

2.3 AICAR 抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡 流式细胞术和TUNEL 结果显示，与H2O2组比较，H2O2+AICAR 组细胞凋亡水平下降 [（10.67±2.11）%比（21.82±3.22）%，P＜0.05]（见图3A、B）。Western blot结果显示，与H2O2组比较，H2O2+AICAR 组Dhcr24表达水平显著升高（P＜0.05），见图3C。

图3 AICAR 抑制H2O2 诱导的心肌细胞凋亡

2.4 AICAR 通过Dhcr24 抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡 为了验证AICAR 通过调控Dhcr24 抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，首先在细胞中敲低Dhcr24 的表达水平（见图4A）。在H2O2+AICAR 处理心肌细胞的基础上，细胞中敲低Dhcr24，降低的细胞凋亡水平能够被一定程度逆转 [（15.71±1.57）%比（9.50±0.89）%，P＜0.05]，见图4B、C。

图4 AICAR 通过Dhcr24 抑制H2O2 诱导的心肌细胞凋亡

3 讨论

心肌梗死期间，局部心肌氧化应激水平由于缺血和缺氧而异常升高，导致大量心肌细胞死亡，心肌纤维化，最终心力衰竭[4]。保护存活的心肌细胞以改善心肌梗死后的左心室功能一直是心血管领域研究的重点课题。有研究证明，H2O2可诱导H9C2 细胞的凋亡[11]。AMPK 是调节细胞代谢以维持能量平衡的关键能量传感器[12]，AMPK 表达的抑制可导致心肌细胞凋亡、加重氧化应激[13]。AICAR、橄榄苦苷、噻虫嗪和二甲双胍已被证明可以作为AMPK 的激动剂，具有心脏保护作用[14]。AICAR 被证明在包括高血压[15]、急性肾损伤[16]、心脏缺氧[18]等疾病模型中，作为AMPK 激动剂发挥心脏保护作用。另有研究显示，AICAR 可以作为AMPK 激动剂来探索运动对缺血性心肌的保护作用[17]。本研究结果表明，AICAR 可以显著抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，上调细胞Dhcr24 表达水平。

Dhcr24 是一种多功能蛋白质，具有胆固醇合成和抗凋亡活性。Dhcr24 的表达已经在多种不同的器官中被检测到，包括大脑、肾上腺、卵巢等。在我们的研究中发现，Dhcr24 在H2O2诱导的心肌细胞中显著降低[18]。据研究显示，Dhcr24 表达减少，与肾上腺皮质细胞凋亡增加有关。此外，Dhcr24 被认为参与大脑中的抗凋亡功能，其在颞叶皮层中的表达减少，参与阿尔茨海默病的病理发展[19]。更重要的是，在一项关于扩张型心肌病的分子机制研究中，抑制Dhcr24 的表达，能够显著增强H2O2诱导的心肌细胞凋亡[18]。本研究结果显示，在H2O2诱导的心肌细胞中敲低Dhcr24 水平，可显著逆转细胞凋亡。

本研究表明，AICAR 通过Dhcr24 抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，Dhcr24 在心肌梗死后有氧运动诱导的心脏保护作用中发挥积极作用。然而，本研究是基于细胞水平，针对心肌细胞凋亡后运动康复的研究，存在局限性，缺少动物及临床上的验证。在未来的研究中，我们将完善动物及临床水平的验证，以增强结果的可信度。