益气祛痰解毒方通过调控FRMD6 抑制非小细胞肺癌进展的作用机制研究

姚 成 陈 冬 陈滨海 高文仓

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%且中晚期患者生存率极低[1]。中药具有丰富的生物活性，通过多途径和多靶点在肿瘤治疗中发挥作用[2]。益气祛痰解毒方以泽漆汤为主，具有益气祛痰、解毒散结的功效，临床上用于肺癌治疗且具有抗表皮生长因子受体（EGFR）-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药性[3]，但是其在NSCLC 中的作用机制尚不清楚。本文旨在研究益气祛痰解毒方与FERM 结构域蛋白6（FRMD6）在NSCLC 中的分子调控机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株和试剂 PC9 细胞株购自美国ATCC（批号CRL-5908）；中药材由浙江中医药大学附属第二医院中药房提供；RPMI1640 培养基（批号A4192301）、胎牛血清（批号12664025）、青霉素和链霉素（批号15070063）等购于美国Gibco 公司；空白对照载体（shNC）和FRMD6 干扰载体（shFRMD6）及慢病毒包装质粒购自上海吉玛基因公司；CCK-8 试剂盒（批号C0037）、Trizol 试剂盒（批号R0016）、逆转录试剂盒（批号D7168S）、Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒（批号C1062M）和BCA 试剂盒（批号P0012S）购于上海碧云天生物技术有限公司；FRMD6（批号PA5-51553）和肝细胞生长因子受体基因（c-Met）（批号37-0100）购自美国ThermoFisher 公司；磷酸化PI3K（p-PI3K）（批号17366）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）（批号4249）、磷酸化Akt（p-Akt）（批号13038）、蛋白激酶B（Akt）（批号9272）、β 肌动蛋白（β-actin）（批号4970）和IgG/HRP（批号7074）购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.2 主要仪器 酶标仪（型号：680）、实时荧光定量PCR 仪（型号：9600）和电泳仪（型号：1658001）购自美国Bio-Rad 公司；流式细胞仪（型号：FACSCalibur）购自美国BD 公司。

2 实验方法

2.1 益气祛痰解毒方制备 益气祛痰解毒方：泽漆、石见穿各30 g，前胡10 g，人参、桂枝、黄芩、半夏各9 g，红豆杉8 g，蜂房15 g，生姜5 g。制备益气祛痰解毒方提取物干粉并配置成1 mg/mL 的药液，储存于4 ℃冰箱中备用。

2.2 细胞培养、慢病毒转染及分组 PC9 细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素的RPMI1640 培养基在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。取指数生长期的PC9 细胞，空白对照载体和shFRMD6 的RNA 干扰慢病毒液感染PC9 细胞，构建空白对照载体组PC9 细胞株（shNC）和FRMD6 敲低PC9 细胞株（shFRMD6）。分组：对照组、益气祛痰解毒方组、shNC 组、shFRMD6 组、益气祛痰解毒方+shNC 组、益气祛痰解毒方+shFRMD6 组。

2.3 细胞增殖实验 参考CCK-8 试剂盒说明书检测细胞增殖，细胞（1×103个/孔）接种于96 孔板，在37 ℃、5% CO2中培养，24 h 后加入CCK-8 溶液，再培养4 h 后利用酶标仪检测450 nm 处各组OD 值。细胞活性（%）=（实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。

2.4 实时定量PCR 检测 根据Trizol 试剂盒说明提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明合成cDNA，采用实时定量PCR 仪检测，反应条件为93 ℃10 min、95 ℃30 s、60 ℃1 min、72 ℃1 min，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算FRMD6 相对表达水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：FRMD6 正向：5'-CTTCCCAACGATGAATCTCTGAA-3'，反向：5'-GGCAGTCCTTTAGCCTGAGC-3'；GAPDH 正向：5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向：5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3'。

2.5 Western blot 检测 PC9 细胞于6 孔板培养24 h，经冲洗、RIPA 裂解后提取总蛋白质，利用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取20 μg 于缓冲液中，经电泳分离后转移至PDVF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h 后，按1∶1000 加入一抗（FRMD6、c-Met、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin）4 ℃孵育过夜。后加入二抗（IgG/HRP，1∶2000）室温反应2 h 并获取显影蛋白条带。

2.6 细胞侵袭实验 制备浓度为2×105/mL 的细胞悬液，Transwell 小室的上层膜表面均匀铺上基质胶，取200 μL/孔的PC9 细胞悬液加入上层，向下层中加入600 μL/孔的完全培养基（含20%血清），于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，用0.1%结晶紫染液对下层细胞进行染色，置于显微镜下观察拍照收集图像。

2.7 细胞凋亡检测 根据Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒说明检测各组细胞凋亡，将PC9 细胞加入5 μL Annexin V-/FITC 后避光反应20 min，然后加入5 μL PI 避光反应20 min，利用流式细胞仪检测PC9 细胞凋亡情况。

2.8 统计学方法 所有数据利用GraphPad Prism 8.0 软件处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间均数比较，采用t 检验，多组间均数比较，采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 益气祛痰解毒方上调FRMD6 表达水平 研究表明，FRMD6 有抑制肿瘤的作用[4]。CCK-8 检测发现，益气祛痰解毒方显著抑制PC9 细胞增殖（P＜0.05）（见表1），进一步qRT-PCR 检测显示，与对照组比较，益气祛痰解毒方组的FRMD6 表达水平显著升高（P＜0.01）（见表2）。同时，Western blot 检测结果与qRT-PCR 结果一致，见图1。

表1 PC9 细胞增殖率（%，）

表1 PC9 细胞增殖率（%，）

注：对照组为正常培养的PC9 细胞；益气祛痰解毒方组为用益气祛痰解毒方（1 mg/mL）处理的PC9 细胞；与对照组比较，aP＜0.05

表2 PC9 细胞FRMD6 表达水平（）

表2 PC9 细胞FRMD6 表达水平（）

注：对照组为正常培养的PC9 细胞；益气祛痰解毒方组为用益气祛痰解毒方（1 mg/mL）处理的PC9 细胞；FRMD6 为FERM 结构域蛋白6；与对照组比较，aP＜0.01

图1 Western blot 检测PC9 细胞FRMD6 蛋白表达

3.2 益气祛痰解毒方通过上调FRMD6 抑制PC9 细胞增殖和促进凋亡 FRMD6 参与肿瘤细胞增殖和凋亡的调控[5]。本实验利用慢病毒感染构建FRMD6敲低PC9 细胞株，qRT-PCR 显示，与对照组比较，shFRMD6 组FRMD6 表达显著降低（P＜0.05）（见表3）。同时，Western blot 检测结果一致，见图2A。

表3 PC9 细胞FRMD6 表达水平（）

表3 PC9 细胞FRMD6 表达水平（）

注：对照组为正常培养的PC9 细胞；shNC 组为转染空白对照载体的PC9 细胞；shFRMD6 组为转染FRMD6 敲低质粒的PC9 细胞株；FRMD6 为FERM 结构域蛋白6；与对照组比较，aP＜0.05

CCK-8 检测发现，与shNC 组比较，益气祛痰解毒方+shNC 组PC9 细胞增殖率显著降低（P＜0.05），而shFRMD6 组PC9 细胞增殖率升高（P＜0.01）。此外，与益气祛痰解毒方+shNC 组比较，益气祛痰解毒方+shFRMD6 组PC9 细胞增殖率显著上升（P＜0.01）（见表4）。Annexin V-FITC/PI 显示，与shNC 组比较，益气祛痰解毒方显著抑制PC9 细胞凋亡，并且敲低FRMD6 会显著减弱益气祛痰解毒方对PC9 细胞凋亡的作用，见图2B。

表4 各组PC9 细胞增殖率比较（%，）

表4 各组PC9 细胞增殖率比较（%，）

注：shNC 组为转染空白对照载体的PC9 细胞；shFRMD6 组为转染FRMD6 敲低的PC9 细胞株；益气祛痰解毒方+shNC 组为用益气祛痰解毒方（1 mg/mL）处理的转染空白对照载体的PC9 细胞；益气祛痰解毒方+shFRMD6 组为用益气祛痰解毒方（1 mg/mL）处理的转染FRMD6 敲低质粒的PC9 细胞株；FRMD6 为FERM 结构域蛋白6；与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与益气祛痰解毒方+shNC 组比较，cP＜0.01

3.3 益气祛痰解毒方抑制PC9 细胞侵袭 Transwell显示，与shNC 组相比，益气祛痰解毒方+shNC 组显著抑制PC9 细胞侵袭，而shFRMD6 组则促进PC9细胞侵袭。此外，与益气祛痰解毒方+shNC 组比较，益气祛痰解毒方+shFRMD6 组PC9 细胞侵袭增强，见图2C。

图2 Western blot 检测PC9 细胞FRMD6 蛋白表达（A）；各组PC9 细胞凋亡（B）和侵袭（C）比较

3.4 益气祛痰解毒方通过调控FRMD6 表达来抑制c-Met/PI3K/Akt 通路 c-Met/PI3K/Akt 通路与NSCLC细胞功能调控密切相关[6]。Western blot 检测显示，与shNC 组比较，益气祛痰解毒方+shNC 组c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表达显著下调；而shFRMD6 组上调c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表达，这表明下调FRMD6表达能够激活c-Met/PI3K/Akt 通路。与益气祛痰解毒方+shNC 组比较，益气祛痰解毒方+shFRMD6 组c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表达显著上调，表明敲低FRMD6 会影响益气祛痰解毒方对c-Met/PI3K/Akt通路的抑制作用，见图3。

图3 c-Met/PI3K/Akt 通路的蛋白表达

4 讨论

NSCLC 是临床上常见的恶性肿瘤[7]。中药已广泛用于肿瘤的治疗且在预防肿瘤转移和耐药中表现出积极作用[8]。研究表明，长期服用吉非替尼会产生较强的耐药性，不利于NSCLC 患者的治疗[9]。NSCLC 患者存在c-Met 过度激活进而导致肿瘤细胞恶性发展的情况，同时c-Met 通路的异常激活是NSCLC 耐药的机制之一[10]。已有研究表明，益气祛痰解毒方可以通过调节PI3K/Akt/mTOR 通路来抑制NSCLC 发展[11]。

研究表明，中药与癌症的信号通路和分子靶点具有密切关系[8]。FRMD6 为一种新型肿瘤抑制因子，是调节细胞生长和分化的上游通路调控蛋白，调控FRMD6 可抑制肝细胞癌和前列腺癌等癌症的发展[4]。本文研究发现，益气祛痰解毒方能够上调FRMD6 的表达，而敲低FRMD6 会影响益气祛痰解毒方对PC9细胞的抑制效果。此外，研究发现推动NSCLC 发展的部分原因与c-Met 扩增有关，c-Met 通过激活下游信号通路促进NSCLC 细胞增殖和转移[12]。FRMD6 可通过下调c-Met 蛋白表达来癌细胞发展[5]。本研究结果表明，益气祛痰解毒方通过调控FRMD6 表达从而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。

综上所述，益气祛痰解毒方在抑制NSCLC 发展方面作用显著。同时，益气祛痰解毒方能够抑制NSCLC 的PC9 细胞增殖、侵袭和促进细胞凋亡，其分子机制是调控FRMD6 表达进而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。