脂联素参与七氟醚预处理保护心肌缺血再灌注损伤后小鼠认知功能的机制研究*

王春晖，岳毅，刘少凯，刘小霞，柳元桢，张彦清

（1.山西医科大学麻醉学院，山西太原 030001；2.武警山西总队医院神经外科，山西太原 030006；3.山西医科大学附属第一医院麻醉科，山西太原 030001）

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction, POCD）是指患者手术麻醉后出现思维、行为、学习、记忆和注意力等认知和脑功能的改变[1-2]。在体外循环下的心脏手术中，心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion, MIR）是不可或缺的环节。POCD 已经成为此类手术最常见的并发症[3]。如何最大限度减轻MIR 相关的POCD 和脑功能损伤是目前心脑血管领域亟须解决的重大问题和临床需求。

有研究表明[4-5]，以七氟醚为代表的挥发性麻醉药物预处理可以减轻MIR 引起的POCD，然而其机制尚未完全明确。脂联素是一种主要由脂肪细胞分泌的细胞因子，其在一定程度上延缓了POCD 的发生发展[6-7]，但尚不清楚七氟醚预处理的保护机制是否与脂联素的上调有关。

本研究使用野生健康成年SPF 级雄性C57BL/6小鼠和健康成年SPF 级雄性脂联素基因敲除（adiponectin knock-out, APN KO）小鼠，复制MIR 模型，拟从多角度阐述脂联素在七氟醚预处理保护MIR 模型小鼠认知功能中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器

野生健康成年SPF 级雄性C57BL/6 小鼠30 只，鼠龄8～10 周，体重20～25 g，购自山西医科大学动物实验中心[动物实验生产许可证号：SCXK（晋）2015-0001]；健康成年SPF 雄性APN KO 小鼠40 只，鼠龄8～10 周，体重20～25 g，由上海南方模式生物科技有限公司提供[动物实验生产许可证号：SCXK（晋）2015-0001]。七氟醚（上海恒瑞医药有限公司，国字准药H20070172，规格：100 mL），小鼠脂联素酶联免疫双抗夹心法试剂盒（美国博士德生物工程有限公司，EK0596），脂联素替代剂（AdipoRon）（美国Med Chem Express 公司），2%七氟烷（上海恒瑞医药有限公司，批号：19101331）。小动物呼吸机（美国Harvard 公司）。

1.2 动物分组与模型复制

C57BL/6 小鼠随机分为sham 组、MIR-Control 组及MIR-SevoPre 组，每组10 只。APN KO 小鼠随机分为KO-sham 组、KO-MIR-Control 组、KO-MIR-Sevopre组及KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 组，每组10 只。MIR-Control 组、MIR-SevoPre 组、KO-MIR-Control、KO-MIR-Sevopre 组、KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 组采用结扎冠状动脉左前降支30 min 恢复灌注的方法复制MIR 模型；sham 组和KO-sham 组只穿线不结扎； MIR-SevoPre 组、KO-MIR-Sevopre 组和KOMIR-Sevopre-AdipoRon 组小鼠置于麻醉罐中，通入2%七氟烷10 min 后通入95%O2-5%CO2，循环3 次，每次间隔15 min。KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 组：模型复制前10 min，七氟醚预处理的APN KO 小鼠口服溶于玉米油的AdipoRon 20 mg/kg。

1.3 Morris水迷宫实验

3 组C57BL/6 小鼠及4 组APN KO 小鼠均在模型复制或对照处理后第1 天、第2 天、第4 天进行Morris 水迷宫实验。参照BARNHART 等的方法[9]，每次将小鼠分别从1、2、4 象限中点放入水池，记录小鼠的游泳速率和找到平台时间，即潜伏期，假如小鼠在1 min内还没找到平台，引导小鼠到平台上停留20 s，潜伏期按1 min 计。

1.4 血浆脂联素水平

采集3 组C57BL/6 小鼠在模型复制或对照处理后24 h 的颈总动脉血2.5 mL，4℃、3 000 r/min 离心10 min，取上清液，严格按照小鼠脂联素酶联免疫双抗夹心法试剂盒说明书测定脂联素水平。使用三分位数作为节点，将脂联素水平分为高分子量、中分子量、低分子量3 种，比较3 组C57BL/6 小鼠的总脂联素、高分子量脂联素、中分子量脂联素、低分子量脂联素水平。

1.5 统计学方法

采用Excel 2010 建立数据库，采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较采用重复测量设计的方差分析或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；采用Pearson 法检验相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比较

3 组C57BL/6 小鼠模型复制后第1 天、第2 天和第4 天的游泳速率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的小鼠游泳速率无差异（F=0.543，P=0.584）；②3 组小鼠游泳速率无差异（F=52.907，P=0.375）；③3 组小鼠游泳速率的变化趋势无差异（F=1.266，P=0.295）。见表1。

表1 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比较 （n=10，cm/s，±s）

表1 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比较 （n=10，cm/s，±s）

组别sham组MIR-Control组MIR-Sevopre组第1天17.72±0.61 17.62±0.43 17.11±0.68第2天17.43±0.48 17.45±0.50 17.32±0.79第4天17.47±0.39 17.76±0.55 17.33±0.53

2.2 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较

3 组C57BL/6 小鼠模型复制后第1 天、第2 天和第4 天的潜伏期比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的小鼠潜伏期有差异（F=1662.005，P=0.000）；②3 组小鼠的潜伏期有差异（F=38.685，P=0.000），与sham 组比较，MIR-Control 组各时间点潜伏期延长（P＜0.05），与MIR-Control 组比较，MIR-Sevopre 组小鼠各时间点潜伏期缩短（P＜0.05）；③3 组小鼠的潜伏期变化趋势有差异（F=5.870，P=0.002）。见表2。

表2 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较 （n=10，s，±s）

表2 3组C57BL/6小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较 （n=10，s，±s）

注：①与sham 组比较，P ＜0.05；②与MIR-Control 组比较，P ＜0.05。

第4天10.29±0.97 15.57±1.27①10.22±1.28②组别sham组MIR-Control组MIR-Sevopre组第1天34.09±1.35 35.41±3.20①34.30±1.63②第2天26.73±0.98 30.06±1.23①27.26±1.09②

2.3 3组C57BL/6小鼠的脂联素水平比较

3 组C57BL/6 小鼠的脂联素水平比较，采用方差分析，总脂联素、高分子量脂联素、中分子量脂联素差异有统计学意义（P＜0.05），低分子量脂联素差异无统计学意义（P＞0.05）；进一步两两比较，与sham 组相比，MIR-Control 组血浆总脂联素、高分子量脂联素、中分子量脂联素水平降低（P＜0.05），与MIR-Control 组相比，MIR-Sevopre 组血浆总脂联素、高分子量脂联素、中分子量脂联素水平升高（P＜0.05）。见表3。

表3 3组C57BL/6小鼠的脂联素水平比较（n=10，μg/mL，±s）

表3 3组C57BL/6小鼠的脂联素水平比较（n=10，μg/mL，±s）

注：①与sham 组比较，P ＜0.05；②与MIR-Control 组比较，P ＜0.05。

分组总脂联素sham组MIRControl组MIRSevopre组F 值P 值8.98±0.16 4.99±0.14①高分子脂联素3.59±0.24 1.98±0.13①中分子脂联素1.98±0.11 1.48±0.11①低分子脂联素1.48±0.09 1.48±0.10 7.76±0.16②2.53±0.15②1.67±0.11②1.45±0.09 0.688 0.511 170.261 0.000 6.461 0.000 16.978 0.000

2.4 3 组C57BL/6 小鼠认知功能与脂联素水平的相关性

Sham 组小鼠的潜伏期与脂联素水平呈负相关（r=-0.480，P=0.033），MIR-Control 组小鼠的潜伏期与脂联素水平呈负相关（r=-0.300，P=0.040），MIR-Sevopre 组小鼠的潜伏期与脂联素水平呈负相关（r=-0.730，P=0.019）。

2.5 4组APN KO小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较

4 组APN KO 小鼠模型复制后第1 天、第2 天和第4 天的潜伏期比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点小鼠潜伏期有差异（F=1428.137，P=0.000）；②4 组小鼠的潜伏期有差异（F=34.611，P=0.000），与KO-sham 组比较，KOMIR-Control 组潜伏期延长（P＜0.05）；与KO-MIRControl 组相比，KO-MIR-Sevopre 组潜伏期无差异（P＞0.05）；与KO-MIR-Sevopre 组比较，KO-MIRSevopre-AdipoRon 组潜伏期缩短（P＜0.05）；③4 组小鼠潜伏期的变化趋势无差异（F=2.054，P=0.069）。见表4。

表4 4组APN KO小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较 （n=10，s，±s）

表4 4组APN KO小鼠模型复制后第1天、第2天和第4天的潜伏期比较 （n=10，s，±s）

注：①与KO-sham 组比较，P ＜0.05；②与KO-MIR-Sevopre 组比较，P ＜0.05。

?组别KO-sham组KO-MIR-Control组KO-MIR-Sevopre组KO-MIR-Sevopre-AdipoRon组第1天35.90±3.73 41.90±2.13①37.50±1.58 36.90±2.02②第2天31.90±1.91 37.60±1.51①34.00±2.45 32.30±2.31②第4天11.30±1.49 16.30±2.21①15.00±1.70 14.20±1.75②

3 讨论

脂联素是脂肪细胞分泌的一种多功能蛋白[10]，对认知相关疾病具有保护作用[11]，本团队前期实验结果表明脂联素参与了七氟醚预先给药改善MIR 小鼠的认知功能的过程[12]，但是这种作用是否与血浆脂联素水平升高有关，两者之间是否具有剂量依赖性仍未可知。

MIR 是临床常见的病理生理现象，心脏血液的再灌注会引起机体体内生理环境失衡，并对心[13]、脑[4]等多个脏器产生影响[14]，本研究结果同样证明在MIR 后24 h MIR-Control 组和KO-MIR-Control 组的水迷宫潜伏期延长，认知功能受损。同时本研究结果显示模型复制后各组小鼠游泳速率无明显差异，这提示MIR 影响C57BL/6 小鼠的认知功能但并不影响小鼠的运动功能。有研究表明，七氟醚等[4，15]挥发性气体对MIR 相关的认知障碍具有延缓作用，本研究结果同样显示KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 组潜伏期缩短，认知功能改善。有研究显示，MIR 血液中的脂联素水平降低[16-17]，而脂联素水平与认知功能相关[7，11]，与本研究结果一致。本研究通过对3 组C57BL/6 小鼠的脂联素水平和认知功能进行相关性分析发现，两者之间呈负相关。

2013年，东京大学OKADA-IWABU 教授等[18]筛选与脂联素作用相似的小分子化合物并命名为脂联素受体激动剂AdipoRon。AdipoRon 是否具有和脂联素相似的认知改善作用尚未被证实。本研究结果发现与KO-MIR-Sevopre 组比较，KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 组潜伏期缩短，而KO-MIR-Control 组与KO-MIR-Sevopre 组之间无明显差异，提示七氟醚发挥其保护作用与脂联素有关。

本研究仍存在一些局限性：关于小鼠认知能力的检验方法单一，应采取行为学量表和认知相关蛋白检测相结合的方法，使实验结果更全面客观。此外，七氟醚预处理对MIR 损伤后小鼠认知功能的保护作用是否是直接作用，还是通过降低损伤间接改善认知功能仍是未知的，有待进一步研究。