小青龙汤对过敏性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子失衡及SP、Annexin1、VCAM-1表达的影响

王金凤，王 枫，赵桂芝，于兴娟，祝建材

(山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199)

过敏性鼻炎又称变应性鼻炎，是特应性机体接触变应原后产生的由免疫球蛋白E(IgE)介导的I型超敏反应，多种炎细胞浸润是其主要病理特征[1-2]。现代医学多采用抗组胺药、糖皮质激素等对症处理，短期疗效好，但不良反应大，易复发，严重影响人们的生活质量。中医学认为过敏性鼻炎属“鼻鼽”“鼻嚏”范畴，其是一种以突然和反复发作的鼻痒、喷嚏、流清涕为主要特征的鼻病，主要因脏腑功能虚损在先，继而感受风寒而引发，是正虚与邪侵共同作用的结果，目前公认的证型有肺气虚寒证、脾气虚弱证、肾阳不足证和肺经伏热证4种，其中肺气虚寒证所占比例最高[3-4]。小青龙汤是治疗鼻鼽肺气虚寒型的基本方[5]，既往对于其作用机制的研究主要集中在平衡Th1/Th2、抑制树突状细胞的活化和成熟，进而调节免疫功能方面，对其抗炎机制研究较少[6-7]。本实验通过观察小青龙汤对过敏性鼻炎大鼠炎症介质P物质(SP)、膜联蛋白1(Annexin1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的影响，进一步探讨了小青龙汤治疗过敏性鼻炎的作用机制，旨在为其临床应用提供更多理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雌性SD大鼠48只，5～6周龄，体重160～180 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，合格证编号：370726211100170223，许可证号：SCXK(鲁)20190003。所有动物均在山东中医药高等专科学校医学实验中心动物观察室内饲养、造模、取材，适应性饲养1周，环境温度18～20 ℃，相对湿度60%～70%，光照时间固定，24 h昼夜循环光照，所有动物自由饮水饮食。本实验方案符合山东中医药高等专科学校动物实验伦理规定。

1.2仪器与设备 KD-BM Ⅲ型电脑生物组织包埋机、KD-BL Ⅲ型包埋机冷冻台、KD-2258轮转式切片机、KD-TH Ⅰ型电脑生物组织摊烤烘片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；DP-72光学显微镜(日本Olympus公司)；MK3酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)。

1.3药物与试剂 小青龙汤(由麻黄9 g、芍药9 g、细辛3 g、干姜6 g、炙甘草6 g、桂枝9 g、半夏9 g、五味子6 g组成)饮片购自山东中医药高等专科学校附属医院中药房，经鉴定均为真品，饮片加入蒸馏水500 mL浸泡1 h，煮沸30 min，滤过，药渣加入蒸馏水300 mL，继续煎煮，煮沸20 min，两液混合后用纱布过滤，水浴浓缩至60 mL，即为小青龙汤水煎剂，生药含量为1 g/mL；苍耳子鼻炎胶囊(四川森科制药股份有限公司，国药准字Z20064301，规格：0.4 g/粒，批号：201105)；卵白蛋白、氢氧化铝粉(美国Sigma公司，批号：SLCH2414，MKCM1237)；大鼠白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ) ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：1281728416，961743416)；大鼠IgE ELISA试剂盒(Solarbio，批号：20210416)；兔抗大鼠VCAM-1单克隆抗体、兔抗大鼠Annexin1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号：17274289，9L117)；兔抗大鼠SP多克隆抗体(Affinity，批号：53q1907)；即用型SABC-POD试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：16B07A)。

1.4分组、模型制备与干预 大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为正常组、模型组、苍耳子鼻炎胶囊组和小青龙汤高、中、低剂量组，每组8只。除正常组大鼠外，其余组大鼠参照文献[8-9]方法建立过敏性鼻炎模型。基础致敏：每只大鼠于腹腔内注射由卵白蛋白0.3 mg、氢氧化铝30 mg和生理盐水1 mL制成的混悬液，隔天1次，共7次；滴鼻激发：配制5%卵白蛋白生理盐水液，从基础致敏结束后的第2天(正式实验第15天)开始滴鼻，每侧鼻孔50 μL，连续7 d。于末次滴鼻30 min内观察大鼠挠鼻、喷嚏、流涕情况，通过叠加量化计分法[10]进行统计，积分≥5分即为造模成功，具体评分标准见表1。建模成功后，隔天给予大鼠卵白蛋白1 g/L滴鼻以维持对鼻黏膜的刺激。基础致敏后各组开始灌胃干预(给药量根据人的临床剂量按照体重折算[11])：苍耳子鼻炎胶囊组给予苍耳子鼻炎胶囊溶液0.28 g/kg(相当于人临床等效剂量的7倍)灌胃，小青龙汤高、中、低剂量组分别给予小青龙汤14 g/kg、7 g/kg、3.5 g/kg(相当于人临床等效剂量的14，7，3.5倍)灌胃，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水，均每日1次，连续14 d。

表1 过敏性鼻炎大鼠行为学评分标准

1.5观察指标与方法

1.5.1大鼠行为学评分 于末次灌胃后30 min内观察各组大鼠挠鼻、喷嚏、流涕情况，进行行为学评分。

1.5.2血清IgE、IL-4、IFN-γ水平 大鼠末次灌胃后禁食不禁水16 h，10%水合氯醛(0.003 mL/g)麻醉后腹主动脉取血5 mL,置于不含抗凝剂试管中，室温下放置20 min，3 000 r/min离心20 min，分离血清,按ELISA试剂盒说明书采用双抗体夹心法测定血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平。

1.5.3鼻黏膜组织病理学表现 大鼠取血后去除面部皮毛，掀开鼻骨，打开鼻腔，用镊子夹取鼻头分离鼻中隔黏膜，经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，然后浸蜡包埋，切片。取部分切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、苏木素染色、盐酸乙醇分化、伊红染色、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，最后进行显微镜观察。

1.5.4鼻黏膜组织中SP、Annexin1、VCAM-1表达情况 采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法测定，按SABC试剂盒说明书严格操作。具体步骤：鼻黏膜切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、3%过氧化氢灭活、微波修复、5%BSA封闭，一抗4 ℃孵育过夜(兔抗大鼠SP、Annexin1多克隆抗体、兔抗大鼠VCAM-1单克隆抗体稀释浓度分别是1∶100，1∶200，1∶80，以PBS代替一抗作为空白对照)，二抗37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min后，DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片，显微镜下观察，组织上出现棕黄色即为阳性。每张切片取3个400倍不同视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行半定量分析，记录平均光密度值。

2 结 果

2.1各组大鼠行为学评分比较 正常组、模型组、苍耳子鼻炎胶囊组及小青龙汤高、中、低剂量组大鼠行为学评分分别为(0.75±0.46)分、(6.13±0.83)分、(1.78±0.83)分、(1.65±0.89)分、(2.38±0.5)分、(3.00±0.76)分，模型组大鼠行为学评分明显高于正常组(P<0.05)，小青龙汤各组和苍耳子鼻炎胶囊组大鼠行为学评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且小青龙汤高剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组均明显低于小青龙汤中、低剂量组(P均<0.05)，小青龙汤高剂量组与苍耳子鼻炎胶囊组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比较与正常组比较，模型组大鼠血清IgE、IL-4水平均明显升高(P均<0.05)，血清IFN-γ水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，小青龙汤各组和苍耳子鼻炎胶囊组血清IgE、IL-4水平均明显降低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均明显升高(P均<0.05)；与小青龙汤中、低剂量组比较，小青龙汤高剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组血清IgE、IL-4水平均更低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均更高(P均<0.05)，小青龙汤高剂量组与苍耳子鼻炎胶囊组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比较

2.3各组大鼠鼻黏膜组织病理学表现 正常组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列整齐，纤毛完整，可见少量杯状细胞(箭头所示)；模型组大鼠鼻黏膜上皮不连续，纤毛倒伏、脱落，杯状细胞数量明显增多，并见嗜酸性粒细胞为主的大量炎细胞浸润；与模型组比较，小青龙汤各组和苍耳子鼻炎胶囊组大鼠鼻黏膜上皮细胞的形态和纤毛的完整性不同程度恢复正常,嗜酸性细胞数量不同程度减少。见图1。

图1 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠鼻黏膜组织HE染色表现(×200)

2.4各组大鼠鼻黏膜组织中SP、Annexin1、VCAM-1表达情况 与正常组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中SP、VCAM-1平均光密度值均明显升高(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值明显降低(P<0.05)。与模型组比较，小青龙汤高、中剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组大鼠鼻黏膜组织中SP、VCAM-1平均光密度值均明显降低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均明显升高(P均<0.05)；小青龙汤低剂量组大鼠鼻黏膜组织中SP、VCAM-1平均光密度值无明显变化(P均>0.05)，Annexin1平均光密度值明显升高(P<0.05)。与小青龙汤中、低剂量组比较，小青龙汤高剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组大鼠鼻黏膜组织中SP、VCAM-1平均光密度值均更低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均更高(P均<0.05)，小青龙汤高剂量组与苍耳子鼻炎胶囊组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2～4及表3。

表3 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠鼻黏膜组织中SP、Annexin1、VCAM-1平均光密度值比较

图2 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠鼻黏膜组织中SP表达情况 (IHC，×400)

3 讨 论

过敏性鼻炎是临床最常见的过敏性疾病之一，其是一种由变应原激发、IgE介导、肥大细胞和嗜酸性粒细胞等多种细胞共同参与的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，发病机制复杂，与环境、免疫调控失衡和炎症有关。IgE在过敏性鼻炎发生发展过程中扮演着重要角色，总IgE水平增高可用于判断患者是否为特应性体质，也是过敏性鼻炎的主要诊断指标和治疗靶标[12]。Th1/Th2失衡是过敏性鼻炎发病的重要病理环节[13]。IFN-γ、IL-4分别是Th1和Th2细胞的代表因子，在T细胞分化过程中发挥重要作用。IL-4可促进Th0细胞转化为Th2细胞，活化后的Th2细胞可产生更多的IL-4，进而诱导B细胞产生IgE，促进过敏性鼻炎发生；IFN-γ由Th1产生，是IL-4的拮抗剂，在过敏性鼻炎中起负调节作用[14]。

图3 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠鼻黏膜组织中Annexin1表达情况(IHC，×400)

图4 正常组和过敏性鼻炎各组大鼠鼻黏膜组织中VCAM-1表达情况(IHC，×400)

目前研究认为，炎症介质SP、Annexin1、VCAM-1表达异常与过敏性鼻炎的发病及相关病理学改变有关。SP是由分布于肥大细胞周围的肽能神经纤维所释放的一种神经肽，其可导致血管通透性增加、黏膜水肿、血浆外溢，肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润，引起炎症反应，在过敏性鼻炎发病过程中发挥重要作用[15-16]。Annexin1是最早发现的钙依赖的膜磷脂结合蛋白超家族成员，能刺激巨噬细胞产生抗炎因子IL-10，抑制磷脂酶活性，进而抑制炎症因子合成[17]；可干扰粒细胞黏附、迁移和聚集，诱导中性粒细胞凋亡，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制炎性介质的合成和释放，具有很强的抗炎作用[18]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成员，其在血管内皮细胞上表达，能选择性的将嗜酸性粒细胞黏附到血管内皮细胞上，从而使嗜酸性粒细胞迁移至炎症区域，诱发超敏反应[19]。研究发现，过敏性鼻炎患者VCAM-1水平较健康人显著升高，表明其参与了过敏性鼻炎的病理过程[20]。

本实验结果显示，模型组大鼠经卵白蛋白腹腔注射致敏、双侧鼻腔滴鼻激发后出现挠鼻、喷嚏、流涕等过敏性鼻炎典型症状，病理学观察可见鼻黏膜上皮不连续，纤毛倒伏、脱落，杯状细胞数量明显增多，并见嗜酸性粒细胞为主的大量炎细胞浸润；血清IgE、IL-4水平明显升高，血清IFN-γ水平明显降低；鼻黏膜组织中SP、VCAM-1表达明显升高，Annexin1表达明显降低。表明过敏性鼻炎大鼠存在Th1/Th2细胞因子失衡，炎症介质SP、VCAM-1、Annexin1表达异常，与过敏性鼻炎患者临床特征相似[21]，提示模型复制成功。

小青龙汤源自汉代张仲景的《伤寒杂病论·辨太阳病脉证并治》篇之两条，一条为“伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利、少腹满，或喘者，小青龙汤主之”，另一条为“伤寒，心下有水气，咳而微喘，发热不渴。服汤已渴者，此寒去欲解也。小青龙汤主之”。小青龙汤是治疗“外寒内饮证”的代表方，被临床广泛应用于呼吸系统疾病的治疗，如过敏性哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性鼻炎等[22]。方中麻黄、桂枝发汗散寒以解表邪，且麻黄兼能宣发肺气而平喘咳，桂枝温阳以利内饮；干姜、细辛温肺化饮，兼助麻、桂解表；五味子酸敛护肺；芍药酸敛合营；半夏燥湿化痰，和胃降逆；炙甘草益气和中；诸药合用，共奏解表散寒、温肺化饮之效。现代药理学研究表明小青龙汤具有抗过敏作用，其抗过敏的物质基础是麻黄素和儿茶素[23]。网络药理学分析显示麻黄、甘草的共有活性成分槲皮素，麻黄、白芍、细辛、甘草共有活性成分山柰酚可作用于炎性因子，参与调节免疫功能[24]。苍耳子鼻炎胶囊的主要成分包括苍耳子浸膏粉、石膏浸膏粉、白芷浸膏粉、辛夷挥发油等，是临床治疗过敏性鼻炎的常用中成药[25]。

本实验结果显示，与模型组比较，小青龙汤高、中剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组大鼠行为学评分明显降低，病理学观察见鼻黏膜上皮细胞的形态和纤毛的完整性不同程度恢复正常，嗜酸性细胞数量减少，血清IgE、IL-4水平及鼻黏膜组织中SP、VCAM-1平均光密度值均明显降低，血清IFN-γ水平及鼻黏膜组织中Annexin1平均光密度值均明显升高，小青龙汤高剂量组和苍耳子鼻炎胶囊组各指标改善更明显且2组间各指标比较差异均无统计学意义，小青龙汤低剂量组SP、VCAM-1改善不明显。说明小青龙汤可减轻过敏性鼻炎症状，影响过敏性鼻炎大鼠炎症介质表达，调节Th1/Th2细胞因子产生，以中、高剂量疗效为佳，且呈剂量依赖性，高剂量小青龙汤与苍耳子鼻炎胶囊药效相当。

综上所述，小青龙汤可明显改善过敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜炎性症状，其作用机制可能与抑制炎症介质SP、VCAM-1表达，上调Annexin1表达和调节Th1/Th2细胞因子失衡有关，为经方临床推广治疗过敏性鼻炎提供了依据，但其具体的作用机制有待后续深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。