银杏叶提取物对肺纤维化大鼠Th1/Th2细胞因子和NF-κB p65信号通路的影响

黄茹妍，张鹏飞，罗湘蓉，吴仰聪，潘 玲

(1. 广西中医药大学，广西 南宁 530000；2. 柳州市中医医院，广西 柳州 545000；3. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530000)

特发性肺纤维化是一种局限于肺部的慢性进行性纤维化间质性肺炎，是一种原因不明且不可逆的严重肺部疾病，患者预后较差，生存率低于许多常见类型的癌症[1-2]。目前临床指南推荐用药吡非尼酮和尼达尼布有一定延缓肺纤维化进展的作用[3-6]，但患者的肺功能仍会持续下降，最终发展到终末期呼吸衰竭、甚至死亡。因此，亟待寻找新的能有效减缓或治愈肺纤维化的方法。Kang等[7]实验研究发现，核转录因子κB (NF-κB )信号通路激活可加速由博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程，吡非尼酮干预可抑制NF-κB蛋白表达，提示调节NF-κB信号通路可能会延缓或改善肺纤维化。Xiao等[8]研究发现,间充质干细胞外泌体通过抑制NF-κB信号通路而逆转了由脂多糖诱导的小鼠肺纤维化进程。黄辉等[9]综述了Th1/Th2 细胞平衡与多种器官纤维化之间的关系，发现通过调节Th1/Th2分泌状态可对多种器官的纤维化过程起到抑制或促进作用。近年来有研究发现银杏叶提取物有改善或延缓肺纤维化进展的作用[10-13]，但其防治效果有待大样本研究证实，且其作用机制尚不明确。受上述研究启发，本实验旨在通过观察银杏叶提取物对Th1/Th2细胞的标志性代表因子干扰素-γ(IFN-γ)/白细胞介素-4(IL-4)和NF-κB p65表达的影响，探讨银杏叶提取物能否发挥抑制肺纤维化的作用及其可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 72只SPF级雄性SD大鼠，体重180～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。购回后饲养于广西中医药大学实验动物中心(温度22～25 ℃，湿度60%～70%)，通风良好，常规颗粒饲料喂养，可自由饮水及进食，适应性饲养观察1周。动物实验已通过学校伦理审核。

1.2主要试剂及仪器 NF-κB p65免疫组化试剂盒(武汉拜意尔生物有限公司)，博来霉素(索莱宝生物科技有限公司)，吡非尼酮(北京康蒂尼药业有限公司，国药准字H20133376，规格：100 mg/粒)，金纳多银杏叶提取物片(德国威玛舒培博士药厂，注册证号H20140768，规格：40 mg/片)；显微镜(BX51T-PHD-J11型，日本奥林巴斯)，石蜡切片机(RM2015型，德国莱卡)，离心机(5430/5430R型，德国Eppendorf公司)，低温冰箱(MDF-382E型，日本三洋)，恒温水浴箱(DSHZ-300型，江苏太仓医用仪器厂)。

1.3实验方法 将72只大鼠随机分为正常组、模型组、吡非尼酮组及银杏叶提取物高、中、低剂量组，每组12只。正常组大鼠气管内注射生理盐水(1 mL/kg)，其余组大鼠气管内注射博来霉素溶液(5 mg/kg)制备肺纤维化模型。造模24 h后可正常饮水进食，常规颗粒饲料喂养6 d。于第8天开始，正常组、模型组每日予1 mL生理盐水灌胃；吡非尼酮组每日予50 mg/kg吡非尼酮溶液灌胃，银杏叶提取物高、中、低剂量组每日分别予100 mg/kg、50 mg/kg、25mg/kg的银杏叶片混悬液灌胃，给药体积均为10 mL/kg。各组均连续灌胃21 d。

1.4观察指标及方法

1.4.1肺组织病理形态 实验第29天处死各组大鼠，取肺组织，采用4%多聚甲醛固定。取右肺叶行HE染色和Masson染色(严格按说明书执行)，在光学显微镜下进行病理组织学观察并摄片。根据Szapiel等[14]的方法，用HE染色切片评估肺组织炎症情况，用Masson染色切片评估肺纤维化程度。0级(1分)：无肺泡炎、无纤维化改变；1级(2分)：轻度肺泡炎及纤维化，肺泡结构良好，单核细胞浸润使肺泡间隔增宽，炎症及纤维化改变呈局灶性，病变范围不到全肺的20%；2级(3分)：中度肺泡炎及纤维化，存在较广泛的肺组织炎症及纤维化改变，改变区域大部分从胸膜向内延伸但仍主要以胸膜为主，病变面积占全肺的20%～50%；3级(4分)：重度肺泡炎及纤维化，病变面积超过全肺的50%，可见大小不等的囊气腔，间质和(或)肺泡内可见一些出血区域，可见广泛的肺实质紊乱。

1.4.2肺组织中IFN-γ及IL-4表达情况 取左上肺组织约50 mg，制备单细胞悬液。在含细胞的培养液中加入蛋白转运抑制剂，加入20 μL PE/Cy5标记anti-CD4进行细胞表面染色，混匀，室温暗处孵育15 min，500 r/min离心5 min，弃上清。随后进行固定和破膜，加入0.5 mL的固定剂室温暗处孵15 min，加入PBS，500 r/min离心5 min，弃上清；加入1mL破膜剂室温暗处孵10 min，加PBS洗液，500 r/min离心5 min，弃上清。最后进行细胞内染色，加入荧光素标记抗体IFN-γ-PE、IL-4-PE, 混匀，室温暗处孵育30 min。加洗液，500 r/min离心5 min，弃上清，加入0.5 mL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.4.3肺组织中NF-κB p65阳性表达情况 取4%多聚甲醛固定的右肺叶，行石蜡切片脱蜡水化,PBS液浸泡,一抗孵育过夜,PBS冲洗,标记二抗,缓冲液冲洗后DAB显色,自来水充分冲洗,复染,脱水,透明干燥,封片。镜下观察肺组织切片，并采用Image J软件对免疫组化染色结果进行半定量分析,并计算积分光密度值(IOD)，IOD越大表示阳性反应越强。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织 HE染色和Masson染色病理表现 正常组大鼠肺泡结构清晰，肺泡内无明显炎症细胞浸润，未见病理改变及蓝色胶原沉积；模型组大鼠肺组织结构明显破坏，肺泡萎缩或消失，肺泡间隔明显增宽，肺泡内可见大量炎症细胞浸润和蓝色胶原纤维沉积，呈弥漫性纤维化改变；吡非尼酮组和银杏叶提取物各组大鼠的肺泡结构破坏程度、炎症细胞浸润、纤维化改变程度均较模型组轻，但银杏叶提取物各组病理改变较吡非尼酮组明显。见图1及图2。

图1 正常组和肺纤维化各组大鼠肺组织HE染色情况(×200)

图2 正常组和肺纤维化各组大鼠肺组织Masson染色情况(×200)

2.2各组大鼠肺组织炎症及纤维化评分比较 模型组大鼠肺组织炎症及纤维化评分均明显高于正常组(P均<0.05)；吡非尼酮组和银杏叶提取物各组大鼠肺组织炎症及纤维化评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且吡非尼酮组均明显低于银杏叶提取物各组(P均<0.05)，银杏叶提取物高剂量组均明显低于银杏叶提取物中、低剂量组(P均<0.05)，银杏叶提取物中、低剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和肺纤维化各组大鼠肺组织炎症及纤维化程度评分比较分)

2.3各组大鼠肺组织中IFN-γ和IL-4表达率比较 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中IFN-γ表达率明显降低(P<0.05)，IL-4表达率明显升高(P<0.05)；与模型组比较，吡非尼酮组和银杏叶提取物各组大鼠肺组织中IFN-γ表达率均明显升高(P均<0.05)，IL-4表达率均明显降低(P均<0.05)；与吡非尼酮组比较，银杏叶提取物各组大鼠肺组织中IFN-γ和IL-4表达率均更高(P均<0.05)，银杏叶提取物各组间两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和肺纤维化各组大鼠肺组织中IFN-γ和IL-4表达率比较

2.4各组大鼠肺组织中NF-κB p65表达情况正常组、模型组、吡非尼酮组及银杏叶提取物高、中、低剂量组大鼠肺组织中NF-κB p65表达IOD值分别为5.28±1.55，26.21±4.54，11.07±1.41，13.60±2.30，13.62±2.12，12.79±1.62，模型组明显高于正常组(P<0.05)，吡非尼酮组和银杏叶提取物各组均明显低于模型组(P均<0.05)，吡非尼酮组和银杏叶提取物各组间两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨 论

肺纤维化是肺泡上皮的持续损伤和病理损伤后的异常修复，而后继续发展造成的胶原纤维过度沉积和肺组织瘢痕性变化的肺部疾病，其特征之一就是连续的急性肺损伤。目前炎症也被认为是导致纤维化的因素之一[15]，因此通过抗炎疗法有望延缓或改善肺纤维化。Yao等[16]研究发现，银杏叶提取物干预可明显下调脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达水平。Tao等[17]研究发现，银杏叶提取物主要成分黄酮苷可通过抑制白细胞弹性蛋白酶的活性而发挥抗炎作用。本研究团队前期实验研究中也发现银杏叶提取物可在一定程度上减轻或改善大鼠肺组织及肺血管周围炎症，抑制支气管、肺血管结构重塑，有一定延缓肺间质纤维化进展的作用[18-20]。本实验中，HE和Masson染色证实银杏叶提取物可改善博来霉素诱导的大鼠肺组织炎症及纤维化，且高浓度的改善效果优于低浓度，但与吡非尼酮相比存在疗效差异。因此笔者认为，银杏叶提取物有改善肺组织炎症及纤维化的作用，且治疗剂量的选择对于治疗效果而言有着重要意义，但这需要更多的实验研究来证实。

在正常情况下，Th1、Th2细胞因子处于动态平衡状态，一旦受到刺激则容易失衡而引起机体相应变化，有研究发现通过调节Th1、Th2细胞因子之间的平衡可影响肺纤维化的进展[21]。上皮间质转化与器官纤维化的病理生理发生过程关系密切[22]，其中TGF-β是诱导上皮间质转化发生的重要因子之一。作为Th1生物标志物之一的IFN-γ是一种有效的TGF-β抑制剂，因此IFN-γ疗法有望成为一种新的治疗手段。Fusiak等[23]发现特发性肺间质纤维化患者经IFN-γ吸入治疗后，患者肺功能没有经历持续下降的情况，且处于一个疾病稳定的状态。 Wang等[24]研究中发现吸入IFN-γ 可以改变下呼吸道黏膜的多种免疫和组织修复途径，这与下呼吸道微生物群的分类组成与多种免疫途径显著相关，这些途径可能在特发性肺间质纤维化的肺实质损伤/修复过程中起作用。IL-4是Th2细胞的标志性代表因子，Th2细胞作为Th1细胞的公认对手，可以改变与Th1相关的IFN-γ表达水平。李娟等[25]研究发现，随着矽肺大鼠肺纤维化的进展，IFN-γ表达减弱,IL-4表达增强。Xiong等[26]研究发现调节性T细胞(Tregs)可通过促进纤维细胞积累，减弱Th17反应和调节肺组织中的Th1/Th2细胞因子平衡而参与辐射诱导的肺纤维化，Treg耗竭可破坏Th1/Th2的平衡，增强Th1细胞因子的优势(如促进IFN-γ产生)，减少Th2细胞因子(如IL-4)的产生，通过治疗性调节Treg可减慢辐射诱发的肺纤维化进程。本实验以细胞内高表达的IFN-γ代表Th1型细胞,IL-4代表Th2型细胞, 结果显示模型组IFN-γ表达率降低而IL-4表达率升高，吡非尼酮组及银杏叶提取物各组IFN-γ表达率较模型组高而IL-4表达率较模型组低，这与既往研究结果一致。Th1/Th2作为不同的Th细胞亚群，除了标志性代表因子IFN-γ/IL-4之外，尚分泌不同的细胞因子，因此仅观察IFN-γ/IL-4的表达变化尚不能完全反映Th1/Th2细胞的平衡改变对肺纤维化的影响，但这为临床提供了一条银杏叶提取物通过调节Th1/Th2细胞因子平衡而改善肺纤维化的治疗思路。

NF-κB 是调控炎症和免疫反应的主要核转录因子之一，其中起主要调控作用的是由P50和P65亚基组成的异源二聚体[27]。NF-κB被诱导激活时，可促进多种炎症因子的大量释放，刺激成纤维细胞的增生和胶原纤维的沉积，从而促进器官纤维化的发生发展[28]。彭艳芳等[29]和刘卫东等[30]实验研究发现，通过调节NF-κB信号通路可改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。卢林明等[31]的细胞实验结果表明，白杨素能通过影响NF-κB信号通路而抑制上皮间质转化过程，进而产生抗纤维化作用，其机制可能与抑制NF-κB p65的磷酸化和其核转移有关。本实验结果发现，模型组NF-κB p65的阳性颗粒呈优势表达，而吡非尼酮组及银杏叶提取物各组阳性颗粒表达低于模型组。提示银杏叶提取物有可能通过阻断NF-κB p65信号通路，进一步抑制炎症因子的释放，从而延缓肺纤维化的进展。

综上所述，推测银杏叶提取物一方面通过对Th1/Th2标志性代表细胞因子IFN-γ/IL-4的平衡调节，抑制成纤维细胞的积累而起到减轻纤维化的作用；另一方面通过抑制NF-κB p65通路的激活而减轻炎症反应，从而改善纤维化。但该实验存在实验样本量较少、未动态观察各指标变化情况、未观察检测指标上下游信号通路的相关分子变化等不足，仍需进一步实验加以证实。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。