冬凌草甲素对大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡和纤维化及NLRP3炎性通路的影响

赵学飞，陈 凯

(陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712099)

心肌梗死是临床常见的心血管疾病之一，具有很高的发病率和病死率[1-2]。心肌梗死发生会导致心肌结构发生改变，如心肌细胞凋亡、细胞外基质含量升高、心肌细胞纤维化等，其中心肌细胞凋亡和心肌纤维化是持续过度的心肌重构的主要原因，因此抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化可能是防治心肌梗死后心功能持续下降的关键[3-4]。冬凌草甲素是从中草药冬凌草中提取的主要活性成分，具有抗癌、抗菌、抗炎、免疫调节、抑制肝纤维化等作用[5-7]。最新的研究表明，经冬凌草甲素预处理的骨髓间充质干细胞来源的外泌体可通过调节细胞自噬活性抑制细胞凋亡，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，保护心功能[8]。但冬凌草甲素在心肌梗死中的作用及相关机制尚未完全清楚，因此本实验通过建立心肌梗死大鼠模型，观察了冬凌草甲素对大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡和纤维化的影响，并探讨了其可能作用分子机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠75只，8周龄，体重220～240 g，由陕西中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(陕)2021-001。在室温22～24 ℃、相对湿度50%～60 %的条件下分笼饲养，12 h/12 h明暗交替，自由饮水、进食。动物实验操作均按照国际疼痛研究协会和国家动物实验伦理委员会要求进行，严格遵循“3R”原则。

1.2药物、试剂及仪器 冬凌草甲素(纯度≥98%，上海源叶生物公司)；卡托普利(常州制药厂有限公司，国药准字H32023731)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(上海歌凡生物科技公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、化学发光(ECL)试剂(上海碧云天公司)；兔源转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶剪切体(Cleaved Caspase-3)蛋白、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3实验方法 75只大鼠适应性饲养1周后，随机选取15只大鼠作为假手术组，其余60只大鼠采用结扎冠状动脉左前降支的方法[9]建立心肌梗死模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后固定于实验台，连接呼吸机，斜向切开大鼠胸部皮肤，钝性分离组织肌肉层，在大鼠第3与第4肋间打开胸腔，暴露心脏组织，在左心室下缘约2 mm处用6-0线结扎冠状动脉左前降支，左心室前壁颜色变苍白、收缩力减弱表示结扎成功，然后清洗并关闭胸腔，术后心电图显示大鼠心率缓慢且ST段呈弓背向上型抬高即表示心肌梗死模型制备成功。假手术组大鼠暴露冠状动脉左前降支后只穿线不接扎，其余操作相同。术后连续3d肌肉注射青霉素2.5×104IU/d预防感染。心肌梗死造模成功后24 h，将60只大鼠随机分为模型组、冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组，每组15只。冬凌草甲素低、高剂量组大鼠分别给予10mg/kg和20 mg/kg冬凌草甲素腹腔注射，卡托普利组大鼠给予9.322 mg/kg卡托普利腹腔注射，假手术组和模型组大鼠均腹腔注射等量生理盐水，均1次/d，连续干预4周。

1.4观察指标及方法

1.4.1心功能 末次干预结束后12 h，采用超声心动图测定各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESd)、左心室舒张末期内径(LVEDd)和左心室短轴缩短率(LVFS)。

1.4.2心肌梗死面积比 每组随机选取5只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，取心脏，沿着心脏横轴方向进行厚度约为2 mm的切片，将切片置于2%的TTC溶液中避光孵育30 min，随后在4%多聚甲醛中固定约24 h。可观察到正常心肌区显示红色，梗死组织区显示白色，计算梗死面积比。

1.4.3心肌组织病理形态学 每组随机选取5只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，取心脏，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片(约5 μm)。取大鼠心肌组织石蜡切片依次进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，随后用苏木精染液染色，氨水返蓝，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察。

1.4.4心肌纤维化情况 取大鼠心肌组织石蜡切片，常规脱蜡至水，用Weigert 铁苏木素染色液室温避光染色5 min，自来水冲洗，1 %的酸性乙醇分化液分化5 s，自来水冲洗，Masson丽春红酸性复红染色液室温染色8 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸溶液分化3 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，无水乙醇脱水后二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜随机取5个视野，观察各组大鼠心肌组织胶原沉积情况，其中心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。

1.4.5心肌细胞凋亡情况 采用TUNEL法检测：取大鼠心肌组织石蜡切片，脱蜡至水，经蛋白酶K处理30 min，磷酸缓冲液(PBS)漂洗，加入TUNEL反应混合液50 μL，室温反应60 min，PBS清洗3次，加入3，3’-二胺基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水透明，20%甘油缓冲液封片，置于显微镜下观察，其中红色代表凋亡细胞，蓝色为正常细胞，计算细胞凋亡率。

1.4.6心肌纤维化相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白及NLRP3炎性通路相关蛋白表达情况 采用Wertern blot法检测：每组取5只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，取心肌组织，加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取定量蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，分别加入Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、TGF-β1、CTGF、collagenⅠ、collagenⅢ、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GAPDH(稀释比为1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入HRP标记的二抗(稀释比为1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，使用ECL发光液显影，采用凝胶成像仪分析。

1.5统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据统计学分析，采用GraphPad Prism 7.0软件绘制柱状图。实验结果计量数据多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠心功能参数比较 与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS均显著降低(P均<0.05)，LVESd、LVEDd均显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠LVEF、LVFS均显著升高(P均<0.05)，LVESd、LVEDd均显著降低(P均<0.05)，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组各项心功能参数改善情况均显著优于冬凌草甲素低剂量组(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组各项心功能参数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 假手术组和心肌梗死各组大鼠心功能参数比较

2.2各组大鼠心肌梗死面积比比较 假手术组大鼠无心肌梗死发生，模型组、冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌梗死面积比分别为(32.58±3.46)%、(24.67±2.81)%、(13.64±2.11)%、(11.45±1.74)%，冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌梗死面积比均显著低于模型组(P均<0.05)，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组均显著低于冬凌草甲素低剂量组(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组大鼠心肌组织病理形态学表现 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞形态正常、完整；与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，大量细胞变性坏死，可见明显的炎性浸润；与模型组比较，冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌损伤明显较轻，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组较冬凌草甲素低剂量组轻。见图1。

图1 假手术组和心肌梗死各组大鼠心肌组织HE染色病理形态学表现(×200)

2.4各组大鼠心肌纤维化情况比较

2.4.1心肌组织Masson染色纤维化情况 假手术组大鼠心肌结构完整，心肌细胞呈鲜红色，有少量呈蓝色的胶原纤维；模型组大鼠心肌组织出现大量胶原纤维蓝染，胶原增生明显；与模型组比较，冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织胶原纤维蓝染明显减少，胶原增生程度降低，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组大鼠心肌组织纤维化程度较冬凌草甲素低剂量组更轻。见图2。

图2 假手术组和心肌梗死各组大鼠心肌组织Masson染色纤维化情况(×200)

2.4.2心肌组织中心肌纤维化相关蛋白表达情况模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、CTGF、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白相对表达量均显著高于假手术组(P均<0.05)；冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织中TGF-β1、CTGF、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白相对表达量均显著低于模型组(P均<0.05)，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组均显著低于冬凌草甲素低剂量组(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与冬凌草甲素低剂量组比较，P<0.05。

2.5各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较

2.5.1心肌细胞凋亡染色情况及凋亡率 模型组大鼠出现大量凋亡心肌细胞，心肌细胞凋亡率为(29.46±3.11)%，显著高于假手术组的(3.61±1.25)%(P<0.05)；冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠凋亡心肌细胞较模型组减少，心肌细胞凋亡率分别为(25.47±2.83)%、(17.52±2.20)%、(15.69±1.64)%，均显著低于模型组(P均<0.05)，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组大鼠心肌细胞凋亡率均显著低于冬凌草甲素低剂量组(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组心肌细胞凋亡染色情况见图4。

图4 假手术组和心肌梗死各组大鼠心肌细胞凋亡染色情况(TUNEL法，×200)

2.5.2心肌组织中心肌凋亡相关蛋白表达情况与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均显著降低(P均<0.05)；与冬凌草甲素低剂量组比较，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量均更高(P均<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均更低(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组各蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图5。

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与冬凌草甲素低剂量组比较，P<0.05。

2.6各组大鼠心肌组织中NLRP3炎性通路相关蛋白表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相对表达量均显著高于假手术组(P均<0.05)；冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、卡托普利组大鼠心肌组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相对表达量均显著低于模型组(P均<0.05)，且冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组均显著低于冬凌草甲素低剂量组(P均<0.05)，冬凌草甲素高剂量组和卡托普利组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图6。

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与冬凌草甲素低剂量组比较，P<0.05。

3 讨 论

目前，心肌梗死的治疗包括溶栓治疗、介入治疗及药物治疗等，虽然可降低患者病死率，但心肌梗死后常导致心肌功能受损，会并发心律失常、心力衰竭等，预后仍不理想[10-11]。因此，探寻防治心肌梗死后心肌功能受损的有效方法或药物对改善心肌梗死患者预后、降低患者病死率极为必要。冬凌草甲素是天然有机单体化合物，有实验研究证实其对糖尿病心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能具有保护作用[12]。本实验以卡托普利作为阳性对照药，采用超声心电图检测LVEF、LVFS、LVESd、LVEDd以评估冬凌草甲素对心肌梗死后大鼠心功能的影响，结果显示心肌梗死大鼠LVEF、LVFS较假手术组明显降低，LVESd、LVEDd较假手术组明显升高，证实心肌梗死大鼠存在心功能受损；经过冬凌草甲素干预后，心肌梗死大鼠LVEF、LVFS均明显升高，LVESd、LVEDd均明显降低，提示冬凌草甲素可明显改善心肌梗死后大鼠的心功能，且其效果呈一定剂量相关性。

心肌纤维化是促使心肌梗死后心室重构的重要病理过程，持续进展可导致心力衰竭、恶性心律失常和猝死[13]。心肌纤维化的发生过程与多种细胞因子分泌密切相关，其中TGF-β1作为人体重要的促纤维化因子，可通过与受体结合刺激心肌细胞向成纤维细胞转化，并促进collagenⅠ和collagenⅢ的合成和沉积，进而促进心肌纤维化；CTGF是一种含有较多半胱氨酸的分泌蛋白，其过表达具有直接促纤维化作用[14-15]。Fu等[16]研究报道，冬凌草甲素可通过调节TGF-β/Smad 通路抑制成肌纤维细胞分化和博莱霉素诱导的肺纤维化。本实验结果显示，与模型组比较，冬凌草甲素低、高剂量组心肌梗死大鼠心肌组织胶原纤维明显减少，胶原增生程度明显减轻，心肌组织中TGF-β1、CTGF、collagenⅠ、collagenⅢ蛋白相对表达量明显降低，且冬凌草甲素高剂量组各指标改善更明显。提示冬凌草甲素可显著抑制大鼠心肌梗死后心肌纤维化。

心肌梗死伴随着心肌细胞的缺血缺氧、凋亡坏死、炎性反应等多种病理过程，能否及时抑制心肌细胞凋亡、保护心肌组织是改善心肌梗死预后的关键因素之一。细胞凋亡是一种与基因表达相关的细胞自身程序性死亡，其中Bcl-2是抗凋亡因子，在保护细胞存活、抑制细胞凋亡中起着重要作用；Bax是促凋亡因子，抑制Bax表达有利于细胞存活[17]。Caspase-3是激活细胞凋亡级联反应的关键环节，Cleaved Caspase-3是Caspase-3剪切片段，下调Cleaved Caspase-3表达可抑制细胞凋亡[18]。Gong等[19]报道，冬凌草甲素能通过调控 microRNA 214减轻缺氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡和自噬。本实验研究结果显示，心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率及心肌组织中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均明显升高，心肌组织中Bcl-2蛋白相对表达量明显降低；冬凌草甲素干预可显著降低心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率，抑制心肌组织中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达，促进心肌组织中Bcl-2蛋白表达。提示冬凌草甲素可通过抑制心肌细胞凋亡对大鼠心肌梗死后心肌起保护作用。

NLRP3炎性小体是一种大分子多蛋白复合体，由NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白组成，NLRP3炎性小体被过度激活可通过活化的Caspase-1将IL-1β前体和IL-18前体剪切为成熟的IL-1β、IL-18，进而激活下游信号转导通路，产生大量炎性介质，引起机体严重炎症反应，从而引起机体损伤。目前研究发现，NLRP3炎性通路在心肌梗死、缺血性脑梗死等动脉粥样硬化疾病的发病机制中起重要作用[20]，靶向NLRP3炎性小体是治疗动脉粥样硬化的可能靶点。Mauro等[21]研究表明，心肌梗死引起的损伤会促进NLRP3炎性通路的激活，而抑制NLRP3及相关细胞因子的表达能够减轻心肌损伤，防止心室功能恶化和心力衰竭。Gao等[22]报道，选择性NLRP3炎性小体抑制剂MCC950可减轻心肌梗死小鼠心肌纤维化并改善心脏重塑。上述研究说明NLRP3炎性通路在心肌梗死后心功能损伤中发挥着重要作用。Yang等[23]研究表明，冬凌草甲素能够直接与NLRP3结合，特异性抑制NLRP3炎性小体活化，认为冬凌草甲素是NLRP3炎性小体激活的潜在抑制剂。Lu等[24]研究认为冬凌草甲素可通过抑制NLRP3炎性小体途径减轻心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤诱导的心肌损伤。本实验结果显示，冬凌草甲素低、高剂量组心肌梗死大鼠心肌组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相对表达量明显低于模型组。提示冬凌草甲素可通过抑制NLRP3炎性通路相关蛋白的表达，抑制NLRP3炎性通路的激活，进而减轻心肌损伤，防止心肌纤维化，该结果与Lu等[24]研究结果一致。综上所述，冬凌草甲素可有效抑制心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡和心肌纤维化，其作用机制可能与抑制NLRP3炎性通路的激活相关。本研究为心肌梗死的治疗提供了新的候选药物和作用靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。