不同产地味连质量对比及近源植物分子鉴定研究

龙 林，黄 盼，翟红伟，李清安，胡 辉,3,4，黄茜茜*

（1.劲牌持正堂药业有限公司，湖北 黄石 435100；2.劲牌研究院，湖北 黄石 435100；3.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435100；4.湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，湖北 黄石 435100）

味连属是毛茛科中较原始的类群，与产自北美的单种属组成味连亚科。该属全球约18 种，从东亚到北美的温带和寒温带地区均有分布，我国产6种1变种[1]。中药味连是我国知名度极高的常用中药之一，早在《神农本草经》中便有记载，被列为上品。2020 年版《中国药典》[2-3]将毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.（味连）、三角叶黄连Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao（雅连）和云连Coptis teetaWall.收载为中药黄连的原植物。当前市场味连供应主要以栽培品为主，很大程度上药材产地就决定了药材质量。因此，对味连进行产地评价，是获得质量上乘药材的关键。

除产地差异之外，味连还存在用近源植物作为混伪品的问题，进一步影响了药材的质量。传统鉴定方法主要依据叶片的形状、小叶的疏密程度及花萼的长度等形态学性状进行物种的区分，而味连加工成药材后仅保留了根部，很难通过形态学进行鉴定。DNA 条形码技术在中药材鉴定中具有高效、快速、准确率高等特点，是近年来动植物药材鉴定的主要方法之一[4]。ITS2 序列被选为药用植物鉴定的标准DNA 条形码，并已在多个药用植物及其近源植物的鉴定中得到验证。陈士林等[5]建立了信息量丰富的药材DNA 条形码鉴定数据库，涵盖23 262 种药用植物的78 847 条序列（http://www.tcmbarcode.cn/china）。

为了研究不同产地对味连药材的质量影响，本实验参照2020 年版《中国药典》（一部）黄连药材项下方法对30 批味连药材进行多指标测定。另外，利用DNA 条形码技术对味连及其近源植物的ITS2 序列进行了分子鉴定，提出一种鉴别味连真伪的方法，为味连潜在价值的进一步探索提供了科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

味连直接于田间采样，每个药材产地不少于3批，每批不少于5 kg，共30 批（样品编号WL1-WL30），经湖北中医药大学叶晓川教授鉴定为正品，样品信息见表1。复核样品由湖北省药品监督检验研究院进行审核。雅连标准品采购于中国食品药品检定研究院，批号：120913-201310；马尾连，编号：MWL，采自云南维西。另从Gene Bank 下载部分雅连及云连、峨眉味连、五叶味连、五萼味连、短萼味连的ITS2 序列。

表1 味连及其近源植物样品信息Tab. 1 Sequence information of Coptis chinensis and its near source plants

1.2 仪器

U3000 型高效液相色谱仪、ICAPR 型电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尓科技有限公司）；Inertsil ODS-3 色谱柱（日本岛津实验器材有限公司）；Agilent ZORBAX SB-18色谱柱、7890B型气相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；Sceintz-48 型高通量组织研磨机（宁波新芝生物科技有限公司）；T100 型PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 有限公司）；DYY-10C 型电泳仪（北京六一仪器厂）；Gel Doc XR 型凝胶成像系统（武汉辉景科技有限公司）。

2 方法

2.1 味连质量检测方法

参照2020 年版《中国药典》（一部）黄连药材项下方法，对30 批味连药材性状、鉴别、水分、总灰分、二氧化硫残留量、33 种禁用农药残留量、浸出物、主要成分含量等指标进行检测。同时，还按照2020 年版《中国药典》（四部）通则相关方法对样品重金属及有害元素、黄曲霉毒素等安全性指标进行全方位的检测。

2.2 味连及其近源植物的ITS2 序列鉴定方法

2.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序 （1） DNA 提取 样品处理参照陈士林等[6-7]的研究方法，味连药材样品用75%乙醇擦拭表面后，刮去外表皮，取样约60 mg，连同雅连标准品60 mg 使用研磨仪35 Hz，转速1 050，电流0.02A，先研磨2 min，根据样品研磨程度，再研磨3 ～ 6 min。然后，用天根DP305 植物基因组DNA 提取离心柱型试剂盒提取味连样品DNA。提取过程完全按照试剂盒说明书进行，其中根类样品在加入细胞裂解液后65 ℃水浴2 h（或者56 ℃水浴过夜）。

（2） PCR 反应体系 TaqMix 21μL ；引物F 1μL，引物R 1μL；DNA 模板2 ～ 5μL；total 25μL反应体系。（通用引物，正向引物2F: 5’-ATGCGATAC TTGGTGTGAAT-3’，反向引物3R: 5’-GACGCTTCTCC AGACTACAAT-3’）[8]。

Touchdown PCR 反 应 条 件：2F/3R 引 物 退 火 温度是56℃，设定退火温度范围Tm+10-Tm-5 为66 ～51℃: 94℃ 4 min；94℃ 30 sec，66℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，65℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，64℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30s ec，63℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃30 sec，62℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，61℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，60℃1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，59℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，58℃ 1 min，72℃1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，57℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，56℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，55℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，54℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃30 sec，53℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，52℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，51℃ 1 min，72℃ 1 min（20 cycle）；72℃ 10 min。

PCR 扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对条带单一且清晰的PCR 产物纯化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co., USA）测序仪进行双向测序。

2.2.2 数据处理 测序峰图利用Codon Code Aligner V4.2.4 校对拼接，去除低质量区和引物区，从而获得植物类中药材ITS2 鉴定序列，据NCBI和中药材DNA 条形码识别系统操作流程，与标准数据库进行比对，比对算法采用Blast1，E 值设为1.0×10-5[9]，确定样品拉丁名后，与2020 年版《中国药典》规定的基源物种比对。采用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）对所获序列进行比对分析，并基于K2P 模型进行种内种间变异位点和遗传距离的分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1 000 次重复）检验各分支的支持率。根据ITS2数据库网站预测供试材料的ITS2二级结构。

3 结果与分析

3.1 《中国药典》标准检测项

30 批味连药材水分、总灰分、浸出物、指标成分含量等测定结果见表2。

2020 年版《中国药典》（一部）黄连药材中规定味连药材水分≤14%，总灰分≤5.0%，SO2≤150 mg/kg，浸出物≥15.0%，33 种禁用农药残留量不得检出，小檗碱≥5.5%，表小檗碱≥0.80%，味连碱≥1.6%，巴马汀≥1.5%。由表2 可知，有7 个批次味连指标成分含量不合格，8 个批次总灰分检测不合格。

表2 不同批次味连药材多指标测定结果Tab. 2 Multi-index determination results of different batches of Coptis chinensis

3.2 重金属及有害元素检测结果

按照2020 年版《中国药典》 （四部）通则“2321铅、镉、砷、汞、铜测定法”分别对30 批药材进行了检测，结果见表3。

表3 不同批次味连药材重金属及有害元素测定结果Tab. 3 Determination results of heavy metals and harmful elements in different batches of Coptis chinensis

按照《中国药典》中药重金属及有害元素一般性要求铅不得过5 mg/kg，镉不得过1 mg/kg，砷不得过2 mg/kg，汞不得过0.2 mg/kg，铜不得过20 mg/kg 的标准，30 批味连重金属及有害元素检测中，铅有3 批，镉有25 批，铜有11 批达不到要求。

3.3 黄曲霉毒素

按照2020 年版《中国药典》（四部）通则“2351黄曲霉毒素测定法”项下的规定分别对30 批味连药材进行了检测，结果显示黄曲霉毒素B1 均小于1 μg/kg；黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2 和黄曲霉毒素B1 的总量均小于3 μg/kg。按照《中国药典》中药黄曲霉毒素一般性要求每1 000 g 药材含黄曲霉毒素B1 不得过5 μg，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2 和黄曲霉毒素B1 的总量不得过10 μg的标准，30批药材黄曲霉毒素均符合要求。

3.4 ITS2 序列比对结果

33 个样本的ITS 序列的PCR 及测序成功率均为100%。进入NCBI 条形码鉴定系统网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和中药材DNA 条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn），对实验药材的ITS2序列使用BLAST 方法进行鉴定和序列验证[10]，见表4，结果显示实验序列与各自查询序列的相似度达到99%以上，此鉴定结果说明实验药材样本来源准确。

表4 不同批次味连在NCBI 和中药材DNA 条形码鉴定系统中进行序列比对Tab. 4 Sequence comparison of different batches of Weilian in NCBI and DNA barcode identification system of traditional Chinese Medicine

3.5 味连药材及其近源植物ITS2 序列种间变异分析

味连药材及其近源植物ITS2 序列共76 条，利用MEGA7.0 计算ITS2 序列的种间K2P 遗传距离，见表5，结果显示，味连种内遗传距离是0.000 ～0.003，味连和雅连种间遗传距离是0.034 ～0.045，味连和云连的种间遗传距离是0.046 ～0.062，味连和峨眉味连的种间遗传距离是0.041 ～0.073，味连和五裂味连的种间遗传距离是0.048 ～0.080，味连和五叶味连的种间遗传距离是0.141 ～0.152，味连和短萼味连的种间遗传距离是0.034 ～0.041，味连和马尾连的种间遗传距离是0.262 ～0.322。味连和其它味连种间的遗传距离远大于味连种内遗传距离。所以ITS2 序列能很好的鉴定味连药材到味连种。

表5 味连种内及其近源植物种间K2P 距离Tab. 5 K2P distance between species of Coptis chinensis and its near source plants

3.6 味连药材及其混伪品的NJ 树鉴定

基于味连、雅连、云连、峨眉味连、五叶味连、五萼味连、短萼味连及马尾连的ITS2 序列构建的NJ系统聚类树见图1，结果表明味连、雅连、云连、峨眉味连、五叶味连、五萼味连、短萼味连聚成一大支，马尾连单独聚为一大支，在植物学分类上，马尾连属于唐松草属，而其它7 种味连均属于味连属，也可判断8 个品种之间亲缘关系的远近。另外，味连、峨眉味连和五叶味连各自聚成一小支的支持率均在90%以上。因此ITS2 序列作为DNA 条形码可以很好的将味连药材与其他近源植物区分开。

3.7 味连及其近源植物的ITS2 序列二级结构预测

根据http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/所预测的供试样本的ITS2 二级结构见图2，结果可以看出8 个物种在二级结构上差异显著。大味连属的ITS2 二级结构由1 个中心环、一个半环和4 个螺旋区组成，每个螺旋区上又有大小不等、数目各异的茎环结构。首先，马尾连的中心环结构复杂，与其他味连属的药材差异较大，容易区分；其次，五裂味连的中心环结构与其他味连种差别较大，也容易区分；最后，峨眉味连、云连、雅连、味连、短萼味连和五叶味连药材的螺旋区上的茎环数量和大小不同，能够进行区分。可见，通过ITS2 序列的二级结构能够鉴别味连与其近源植物。

4 讨论

黄连属大宗中药材，但来源混杂，《中国药典》就规定了三种基原。味连作为黄连药材的市场主导品种，其质量代表了黄连药材的整体质量。30 批味连药材中，含量不合格占比23.33%，主要集中在四川省大邑县、什邡市、彭州市、峨眉山市等川中地区，可能与当地的气候条件有关，这些地区与雅连主产区（四川洪雅）接近，可能更适宜雅连的生长。总灰分不合格占比26.67%，主要集中在湖北省恩施市、利川市，这可能与当地的土壤条件有关，也有可能是当地所产“鸡爪连”易包裹泥沙，药材初加工时未处理干净而导致总灰分超标。

30 批味连药材的重金属及有害元素、农药残留量、黄曲霉毒素等安全性指标检测结果显示，参照《中国药典》中对中药重金属及有害元素的一般性要求，味连易出现镉、铜、铅超标，尤其是镉元素超标。

除此之外，味连还面临近源植物伪品混入的风险。在我国，味连有6 种1 变种，孙涛等[11]研究表明通过ITS2 序列可以鉴定味连属3 个物种6 份样品，其样品种类和样品量不够充分，只用了ITS2 核酸信息进行分析鉴定。综合市场应用与供求情况，共采集到30 个味连样品及Gene Bank 下载的味连属其它5个种和1 个变种的样品，利用DNA 条形码技术进行鉴定研究，获得味连及其近源植物DNA 条形码序列，并通过使用ITS2 核酸信息及其二级结构信息联合分析，能够显著提升ITS2 的物种鉴定效率[12]。

5 结论

味连药材易出现有效成分含量和总灰分不合格，安全性指标方面易出现镉、铜、铅超标，药材质量方面需重点关注。利用DNA 条形码技术，通过ITS 序列能够成功准确鉴定出味连药材及其混伪品，并基于K2P 模型构建系统进化树判断样品间的进化关系，这不仅为正确区分味连药材、减少市场上混淆品的使用，规范、安全地利用味连药材资源提供方法支持，而且为味连种质资源评价、遗传多样性研究和丰富味连属DNA 条形码数据库提供帮助。