Sirt1对小鼠肝再生影响的研究

魏 韬 周晶琳 徐绍娜 刘 洋 陆 迪 祝慧慧

（牡丹江医学院基础医学院，黑龙江 牡丹江，157011）

小鼠部分肝切除是一种简单、有效且安全的肝损伤模型，术后肝功能的恢复主要取决于残余肝脏的迅速再生能力。因此，研究肝再生的分子机制具有重要的临床意义。

组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1是Sirtuins家族成员之一，在哺乳动物细胞中普遍表达，主要定位于细胞核和细胞质中。Sirt1通过对靶蛋白去乙酰化作用参与机体的多种生物过程，如基因转录、氧化应激、能量代谢、细胞衰老和免疫炎性反应等。研究表明，Sirt1在肝癌组织和细胞系中高表达，提示其在肝癌的发生、发展过程中可能发挥着重要的生物学作用。通过Sirt1对大鼠肝毒性药物化学损伤肝脏的细胞保护及细胞毒性的调节作用的研究，表明Sirt1很可能是作为参与肝保护的因子。然而，Sirt1在肝再生过程中的作用还不清楚，亟需深入研究探讨。因此，本研究以小鼠为研究对象，对Sirt1在肝再生中的作用进行初步调查研究，以期为临床肝再生治疗提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 仪器和药品

①实验仪器：LD4-2A型低速离心机（生产企业：北京医用离心机厂） ，世安通风柜（生产企业：北京世安科兴科技开发有限公司），FA1104型电子天平（生产企业：上海良平仪器仪表有限公司） ，101-2AB型电热鼓风干燥箱（生产企业：天津市泰斯特仪器有限公司） ，微量紫外分光光度计（生产企业：美国Thermo Fisher有限公司），EcoTMReal-Time PCR仪（生产企业：Illumina有限公司），高压灭菌锅（生产企业：上海博讯有限公司），肝素钠抗凝管（生产企业：石家庄康卫仕医疗器械有限公司），生物安全柜（生产企业：苏州安泰空气技术有限公司）、狗兔二用解剖台（生产企业：上海康为医疗科技发展有限公司），手术灯、鼠笼、小鼠固定用泡沫砖、大头针、固定线、注射器、针头、手术刀、手术剪、手术镊、眼科剪、蚊式止血钳、眼科镊、培养皿、缝针、非吸收性外科缝线、无菌纱布、无菌棉球、一次性使用灭菌橡胶外科手套。0.9%氯化钠溶液、 医用乙醇、碘伏、乌拉坦。

②实验药品：TRIzol plus RNA purification Kit，PrimeScript Reverse Transcriptase和SYBR Green Supermix（生产企业：大连宝生物有限公司），谷丙转氨酶试剂盒（生产企业：南京建成生物工程有限公司）。

1.2 实验动物及分组

本实验中使用的小鼠均来自于牡丹江医学院实验动物中心。饲养在SPF级环境中，温度控制在（22.0±2.0）℃，饲喂普通饲料，自由进食和进水。在具体实验过程中，将15只健康状态良好且体质量为20～25 g的BALB/c小鼠（8周龄）随机分为肝切除组12只，对照组3只。对照组BALB/c小鼠处理方式为打开腹腔后随即缝合；而实验组在进行70%肝切除术后需要继续喂养，并在术后12 h、24 h、48 h和72 h时分别随机取3只小鼠处死，其中对照组在假手术后立即处死。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠的捉拿、麻醉和固定方法

麻醉药物选用20%乌拉坦，采用0.5 mL/100 mg剂量注射。首先使用手术镊夹住小鼠尾部将其从鼠笼中取出，用右手提起小鼠尾后部，转至其眩晕后，将其置于电子秤上的烧杯内称体质量，准确读取数值。麻醉时需用右手提起小鼠尾部将其置于鼠笼盖表面上，此时确保小鼠后肢悬空，仅允许其前肢着地，用左手拇指和食指紧紧抓住小鼠双耳及其头颈部的被毛。让小鼠仰卧位固定于左手中，本实验可采用腹腔注射，穿刺部位选择在其左下腹处，麻醉时将注射器针头与其腹中线成45°，针头刺入角度应与腹部皮肤呈 20°，刺入后缓慢注入药物。将麻醉好的小鼠仰卧位固定于狗兔二用解剖台泡沫砖上，四肢用固定绳分别系于泡沫砖侧面的4只大头钉上。头部用固定绳系住小鼠门齿固定于泡沫砖一端大头钉上。

1.3.2 小鼠肝切除手术操作方法

所有手术器械手术前需要进行高压灭菌。手术过程中，可先用手术剪逐一剪去小鼠腹部中线处被毛，充分暴露其腹部皮肤，随后采用医用乙醇对其进行消毒。两人操作时，一人双手持止血钳夹持腹部正中线两侧的皮肤并尽量向上提起，以防止伤及脏器，另一人用手术剪自剑突下剪开被毛3 cm，然后同样用手术剪自剑突下剪开腹部皮肤和肌肉组织3 cm，使用蚊式止血钳牵拉腹腔切两侧，暴露小鼠腹腔后便可清晰见到肝脏。视野下小鼠肝脏可分为四个解剖功能单位，包括中叶、左外叶、右叶和尾叶。分别结扎并切除肝脏左外叶和中叶，建立70%肝切除小鼠模型。术后迅速缝合腹部切口，并注射抗生素，待小鼠苏醒后确保其能正常进食、进水，确保小鼠能够继续存活。

1.3.3 小鼠肝脏体质量比测定方法

实验过程中所有小鼠需要在不同时间点称量体质量，即在术前和术后12 h、24 h、48 h和72 h时称量体质量，并在处死后取肝脏称量质量，计算不同时间点肝脏体质量比[肝脏相对质量 =肝脏质量（g）/体质量（g）×100%]，随后将肝脏保存于液氮中，以备后续RT-qPCR实验使用。

1.3.4 血清中谷丙转氨酶活性测定方法

从小鼠眼球取血，使用肝素钠抗凝管收集1 mL小鼠血液，随后立即在4 ℃条件下离心10 min，分离出血清。每只小鼠血清分离出后应立即测定谷丙转氨酶ALT含量，血清中谷丙转氨酶ALT含量按照试剂盒操作说明书进行测定。

1.3.5 RT-qPCR法检测肝组织中Sirt1 mRNA水平

取出对照组和实验组术后48 h的肝组织，放入DEPC水预处理的研钵中，加入液氮快速研磨。采用TRIzol法提取肝组织中的总RNA，利用微量紫外分光光度计（生产企业：美国Thermo Fisher公司）检测所得的总RNA浓度和纯度。使用Takara反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA后，通过EcoTMReal-Time PCR仪进行RT-qPCR反应，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，实验中所用的引物序列如下。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组小鼠肝再生过程中肝脏体质量比变化

肝脏具有很强的再生能力，本实验结果表明，在对实验组小鼠实施70%肝切除术后的12～72 h时间范围内，小鼠肝脏体质量比随着时间的延长而逐渐增加，同时也说明在肝再生作用下，小鼠受损伤的肝脏会逐渐得到修复，与手术前比较，损伤肝脏的重量也会相应逐渐增加。见表1。

2.2 两组小鼠血清中谷丙转氨酶水平变化

大部分谷丙转氨酶存在于肝细胞的胞质中，当肝脏受到损伤时，胞质中的谷丙转氨酶释放入血，导致血清中谷丙转氨酶活性升高。与此相一致，本实验结果表明在小鼠肝脏造成损伤后的12～24 h，血清中谷丙转氨酶活性随着时间的延长而逐渐升高；而随着时间继续延长，在损伤后24～72 h，血清中谷丙转氨酶活性随着时间的延长而呈逐渐下降趋势。这些结果表明，小鼠肝损伤会导致血清中谷丙转氨酶活性升高，而在肝再生作用下，小鼠损伤的肝脏会逐渐得到修复，从而促使血清中谷丙转氨酶活性逐渐下降，直至恢复到接近肝脏受损前的水平。见表2。

2.3 两组小鼠肝组织中Sirt1的mRNA水平变化

通过RT-qPCR实验发现，与对照组相比，实验组行70%肝切除术后48 h，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1的mRNA水平较低；本实验结果表明，肝切除会导致组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1转录水平降低，该变化可能与肝再生过程密切相关。见图1。

3 讨论

肝脏是重要的代谢器官和解毒器官，当乙醇或有毒物质摄入、自身免疫刺激、病毒性肝炎等多种因素引起肝脏损伤时，处于静止期的肝细胞进入细胞周期并进行增殖，表现出强大的再生和修复能力，但是酗酒或慢性病毒性肝炎引起大量肝细胞坏死时，肝脏的再生能力便不足以维持自身功能，导致肝功能衰竭。

组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰基转移酶共同调控的动态平衡。乙酰化能增强赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA之间的排斥力，激活基因转录；相反，去乙酰化能清除乙酰基团，使染色质结构由疏松转为致密状态，从而导致基因沉默。研究表明，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1参与组蛋白H4K16去乙酰化修饰过程。也有报道证实，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1也能够参与非组蛋白HMGB1、P53等的去乙酰化修饰过程。综上所述，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1能够参与多种生物学过程，并且发挥了重要的生物学作用。在肝脏中，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1能够调控并编码代谢途径所涉的相关酶。肝脏中组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1的缺失显著影响了细胞G1/S期的进展，这可能与脂肪酸-β氧化缺陷引起的脂质积累有关。研究证实，Sirt1在小鼠肝再生过程中具有调节肝细胞增殖、昼夜节律和脂质代谢的重要作用。近期研究表明，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1参与到肝癌的发生、发展过程中。当前更多的热点集中到组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1与肝癌及肝再生过程的相关性研究。70%肝切除会对小鼠肝脏造成损伤，在术后12 h、24 h、48 h，实验组ALT活性均高于对照组，与对照组比较，术后12 h实验组ALT活性约是对照组的4.5倍，术后24 h实验组ALT活性是对照组的6.5倍，术后48 h实验组ALT活性是对照组的3.6倍；与对照组比较，术后72 h，ALT活性基本恢复到损伤前的水平。本研究发现，小鼠70%肝切除术后48 h，Sirt1的mRNA水平降低，因此推测Sirt1的去乙酰化酶活性可能参与了小鼠肝再生过程，为阐明肝损伤后的肝再生过程提供了新的思路。为应对各种类型的损伤，肝脏会迅速地做出反应，通过再生以恢复其原来的大小和功能。部分肝切除术后的肝再生是研究肝细胞增殖最有效的模型之一，涉及复杂的信号事件以及复杂的相互作用，许多问题仍需阐明。在切除啮齿动物2/3的肝脏后，残留的肝细胞会迅速进入细胞周期，并进行大约两个周期的细胞分裂。许多因素，包括激素、细胞因子、生长因子及其耦合信号转导途径，有助于启动和促进肝细胞通过G1/S期的进展，进入到随后的细胞分裂。该过程所涉及的相关基因以不同的时间方式被激活，从而维持了再生过程的效率。此外，特定的代谢变化也与肝脏再生过程有关。特别是在肝再生过程中发生了短暂的脂肪变性，这似乎对适当的再生反应很重要，但是其功能尚不明确。Sirt1在哺乳动物正常肝功能的控制中起着核心作用，并参与调节包括糖异生、脂肪酸-β氧化和胆固醇等的代谢过程。Sirt1在肝脏中的表达和活性调节导致了肝脏昼夜节律基因表达和代谢的改变，这表明其在维持肝脏代谢和表观遗传调控过程中具有极其重要的作用。然而，组蛋白去乙酰基转移酶Sirt1是如何参与到小鼠肝再生过程中，如何发挥作用，需要进一步展开深入的研究和探讨，以期为今后的临床研究工作提供更加详实的基础数据。